肺炎支原体P1黏附蛋白基因的克隆与表达

发布时间：2020-04-03 18:46

【摘要】：目的对肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,Mp)3’端的P1黏附蛋白基因片段进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和表达产物的免疫性分析,为临床诊断试剂和疫苗的研制打下基础。方法应用PCR技术直接从MpFH株染色体DNA中扩增894bp的3’端p1基因片段(p1’),将此基因片段插入表达载体pGEX-6P-1后,转入大肠杆菌BL21扩增后提取重组质粒进行酶切、PCR扩增及核苷酸测序进行鉴定。诱导阳性克隆株表达重组蛋白后纯化,用兔抗Mp多克隆血清通过免疫印迹实验鉴定其免疫反应性。结果插入重组质粒的p1基因片段经测序后,与GenBank中p1基因核苷酸序列(AF290001、AF290002、AF286371、AE000002、M21519、M18639)比较,其同源性为99.66%～100%。氨基酸序列同源性为99.32%～100%。经SDS-PAGE分析,重组蛋白的相对分子量约为59kDa。免疫印迹实验证实重组蛋白是P1黏附蛋白抗原。结论成功构建了pGEX-6P-1-p1’重组质粒并获得表达。此p1’基因重组质粒表达的蛋白具有免疫反应性,有希望成为特异性抗原诊断试剂和疫苗的候选抗原。
【图文】：

体DNA为模板进行扩增,扩增的p1’基因长度为894bp,经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定,与预期长度一致,扩增浓度和特异性好。结果见图1。图1　PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析Fig.1　Agarose gel electrophoresis of PCR products1:DNA Marker DL2000;2.bland control;3:PCR prod-uct ofMpp1 gene2·2　表达质粒的构建和鉴定　以重组质粒为模板,PCR可扩增出单一条带,片段长度与预期长度一致。重组质粒用EcoRI酶、XhoI酶进行双酶切产生了4.9 kb和0.9 kb两个片段。用EcoRI单酶切产生一条5.8 kb片段。结果见图2。图2　重组质粒双酶切鉴定Fig.2　Identification of recombinant plasmid by restrictionenzyme digestion1:DNA Marker DL2000;2:pGEX-6P-1 plasmid;3:pGEX-6P-1 digested byEcoRⅠ; 4: pGEX-6P-1 di-gested byEcoRⅠandXhoⅠ;5:recombined plasmid;6:recombined plasmid digested byEcoRⅠ;7:recom-bined plasmid digested byEcoRⅠandXhoⅠ;8:λ-HindⅢdigest; 9:p1gene fragment amplificed byPCR4712005, 21 (6)中国人兽共患病杂志Chinese Journal of Zoonoses

为99.32%~100%。2·4　重组蛋白表达和活性检测　从SDS-PAGE结果(图3-A)可见诱导表达的样品在Mr大约59kDa处有明显条带。免疫印记杂交结果显示(图3-B),兔多价抗血清与过柱纯化的重组蛋白在59kDa处形成了特异的抗原-抗体反应条带,空白对照没有,说明该重组蛋白可被兔抗MP多价抗体识别,其含有P1黏附因子的特异性抗原决定簇。图3　GST-P1 Western Blotting分析(箭头所示为表达带)Fig.3　Western Blotting analysis of GST-P1A.SDS-PAGE 1:protein marker;2:bland control;3,4:purified fusion protein;B.Western Blottig3　讨　　论有研究表明,P1黏附蛋白与黏附相关蛋白P30和40、90kDa的膜蛋白串联在一起,是Mp有效黏附于宿主细胞所必需的〔1〕。已报道在P1黏附蛋白C末端含有高免疫区及与黏附有关的D2区〔2

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本文编号：2613569