人蛔虫感染期幼虫提取物诱导人肺上皮细胞凋亡的实验研究

发布时间：2020-04-07 18:23

【摘要】： 目的: 探讨人蛔虫感染期幼虫提取物是否可以诱导体外培养的人肺上皮细胞凋亡，以及细胞凋亡与提取物浓度和作用时间的相互关系。 方法: 1. 对江西省新建县昌邑乡小学学生实施驱虫治疗，口服双羟萘酸噻嘧啶（30mg／kg体重），服药后24h，从排出的粪便中收集人蛔虫成虫。 2. 解剖人蛔虫雌性成虫子宫，收集虫卵, 用0.5％次氯酸钠去除虫卵蛋白质膜，再将洗涤数次后的虫卵放在0.1N的 H2SO4中培养，30±1℃培养2-3周，镜下观察卵内幼虫确已蜕皮即发育为感染期蛔虫卵。 3. 将感染期卵洗涤数次后移入含有小玻璃珠（直径2mm）的锥形瓶内，人工振荡2-3分钟，幼虫全部破壳而出，然后将此悬液沿管壁轻轻移至装有淋巴细胞分离液的试管中，悬液加至淋巴细胞分离液的表面，1200rpm 离心10分钟，沉淀层即为幼虫层。将获得的幼虫在冰上进行匀浆，反复冻融三次，1000rpm离心10分钟，上清即幼虫提取物，将其贮存在-30℃备用。 4. 根据细胞毒性试验（MTT试验）结果，选用10(g/ml、30(g/ml、100(g/ml、300(g/ml、600(g/ml五种不同浓度的幼虫提取物，诱导人 WP=5 肺上皮细胞（A549）。 分别在诱导后的五个时间段采用HE染色盲法计数和二苯胺法测DNA断裂率观察肺上皮细胞凋亡情况。同时对某个时间和浓度组的样本，加用透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪的方法检测细胞凋亡。 结果: 1. 培养的A549细胞爬片后进行HE染色，光镜观察可见：经过不同浓度幼虫提取物诱导后的肺上皮细胞，其凋亡率明显高于对照组的细胞凋亡率。对照组绝大多数肺上皮细胞都保持原有的生长形状如多角形、梭形，细胞核体积大，完整，染成均一浅蓝色，而经不同浓度幼虫提取物诱导后的肺上皮细胞呈现特征性的凋亡形态学改变，如细胞变小、变圆，细胞核固缩、碎裂，，染色质被染成深蓝色或蓝黑色，细胞膜皱折、卷曲和出泡以及芽生成膜包裹的凋亡小体。在透射电镜下观察，对照组肺上皮细胞核体积大、完整，电子密度均匀。而凋亡的肺上皮细胞核染色质发生边集、核固缩、核碎裂，细胞体积变小、胞浆浓缩、胞浆内空泡增多、胞膜出泡及凋亡小体。经过300(g/ml浓度提取物诱导后的肺上皮细胞，其DNA琼脂糖凝胶电泳呈现特征性“梯状”条带图谱，而对照组肺上皮细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳呈现无规律性的弥散状。流式细胞术检测结果显示：当细胞群出现凋亡时，其二倍体峰值比正常细胞降低，而且出现一个亚二倍体峰。二苯胺法测细胞DNA断裂率结果也显示，五种不同浓度的幼虫提取物诱导后的细胞DNA断裂率明显高于对照组肺上皮细胞DNA断裂率。 2. HE染色和二苯胺法测DNA断裂率的结果，清楚提示人蛔虫感染 WP=6 期幼虫提取物诱导人肺上皮细胞凋亡的两种基本态势，即从各个时间段看，细胞凋亡率随幼虫提取物浓度的增加而增加；从各个浓度组来看，诱导后的5小时之前，凋亡率随着诱导时间的延长而增加，而此后则随时间延长而降低。 结论: 1. 人蛔虫感染期幼虫提取物能够诱导人肺上皮细胞的凋亡。 2. 人蛔虫感染期幼虫提取物体外诱导的人肺上皮细胞凋亡，呈明显的浓度依赖关系，即诱导物浓度越高，凋亡率越高。凋亡发生过程，在时间上表现为双向变化关系，即在凋亡发生后的一定时间内，凋亡率随时间增加而增加，此后凋亡率逐渐降低。这种双向变化关系的程度同时受浓度关系的影响。
【学位授予单位】：江西医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R383

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本文编号：2618236