hTERT重组质粒的构建及其表达

发布时间：2020-04-11 12:52

【摘要】：端粒酶维持线形染色体的端粒末端结构的完整，防止染色体的缩短及和其它染色体的融合。有资料表明超过85％的肿瘤细胞表达端粒酶活性，而在正常组织中很少表达。人类端粒酶主要包括3种成分：人端粒酶RNA成分(hTR)，人端粒酶相关蛋白(hTP1)，人端粒酶逆转录酶(hTERT)。hTERT mRNA的表达水平与端粒酶活性正相关，hTERT只在端粒酶阳性的肿瘤细胞和永生化细胞中表达，正常组织中不表达。许多实验证实了来源于hTERT的多肽可由MHC Ⅰ类分子加工递呈，作为抗原激发肿瘤特异性CTL反应，可杀死不同组织来源的肿瘤细胞。hTERT是一种可表达于多种肿瘤组织中的肿瘤相关抗原，编码hTERT的基因是有很好应用前景的肿瘤免疫治疗的靶基因。 目的： 本课题拟构建hTERT基因真核重组质粒pcDNA3.1-hTERT及原核重组质粒pGEX-4T-1-hTERT，并观察在BL21细菌中原核重组质粒的表达，为进一步探讨以hTERT为靶点的肿瘤基因免疫治疗提供实验基础。 方法： 一．重组质粒的构建及基因测序 1．真核重组质粒pcDNA3.1-hTERT的构建：从肿瘤组织中提取总RNA；用RT-PCR方法扩增出带有Hind Ⅲ，BamH Ⅰ酶切位点的hTERT基因片段；hTERT基因片段与pGEM-T Easy克隆载体连接，将重组子转化入JM109感受态大肠杆菌中，用蓝白筛选，PCR扩增，PvuⅡ酶切鉴定等方法筛选出阳性克隆。用Hind Ⅲ及BamH Ⅰ酶切pGEM-T Easy-hTERT质粒获得目的片段，与Hind Ⅲ及BamH Ⅰ酶切处理过的pcDNA3.1载体连接，重组子转化入JM109感受态大肠杆菌中，用PCR扩增，PvuⅡ酶切鉴定等方法筛选出 郑州大学硕士学位论文 hTERT重组质粒的构建及其表达 阳性克隆并测序。2.原核重组质粒pGEX一4T-1一hTERT的构建:用Rl’- pCR方法扩 增出带有EooRI酶切位点的hTERT基因片段，hTERT基因片段与pGEM一T Easy 克隆载体连接，将重组子转化入JM109感受态大肠杆菌中，用蓝白筛选，PCR 扩增，Pvun酶切鉴定等方法筛选出阳性克隆。用EcoRI酶切pGEM一T Easy一hTERT质粒得到目的片段与用EcoRI酶切过的pGEX一4T-1质粒连接，重 组子转化BLZI感受态细菌，PCR扩增筛选出阳性克隆。基因测序并用Omiga 2.0 软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中公布的已知序列的同源 性。 二.原核重组表达质粒的表达鉴定IPTG诱导带有pGEX一4T-1一hTERT质粒 的BL21细菌融合蛋白的表达，取不同时间的培养物进行SDS一PAGE电泳分析， 并进行薄层凝胶光密度扫描测定目的蛋白表达量，同时对表达产物进行 Westem一blot检测。 结果: 1.成功构建了PcDNA3.1一hTERT真核重组质粒及pGEx一4T-1一hTERT原核 重组质粒。 2.经过测序表明，hTERT基因片段全长951帅，编码由317个氨基酸残基 组成、相对分子量为37KDa的蛋白质。hTERT基因与GenB歇正公布的相应基因 进行同源性比较，结果表明核普酸序列的同源性为98‘73%，其编码产物的氨基 酸序列的同源性为99.68%。 3.对sDS一PAGE结果分析发现，含pGEx一 4T-1一hTERT质粒的BLZI细菌能 够表达出63KDa的融合蛋白。薄层凝胶光密度扫描测定其表达水平最高为 28.4%，以IPTG诱导4小时表达量最高。 4.认七stom一blot检测表明该融合蛋白可被hTERI，多抗识别。 结论: 1，序列分析结果证明了所选取的hTERT基因片段是保守区域，为以hTERT 为靶点的肿瘤免疫治疗研究提供重要的前提。 2.成功构建了peDNA3 .1一hTERT真核重组质粒和pGEX一4T-1一hTERT原核 重组质粒。 3.诱导pGEx一4T-1一hTERT重组质粒，获得分子量为63KDa的GsT-hTERT 郑州大学硕士学位论文 hTERT重组质粒的构建及其表达 融合蛋白。用抗hTERT多抗对融合蛋白进行W七stem blot鉴定，，有明显的抗原抗 体反应，证实融合蛋白中含有hTERT目的基因片段表达的相应抗原蛋白。 4.PcDNA3.1一hTERT真核重组质粒及pGEX一4T-1一hTERT原核重组质粒的成 功构建，为进一步探讨以hTERT为靶点的肿瘤免疫基因治疗研究提供了重要的 实验依据。
【图文】：

士学位论文hTERT重组质图1pG阴seTEasy质粒(克隆载体)图谱M一TEasy是为方便PCR产物克隆、蓝白筛选重组体、体外转设计的载体。它由以下部分组成:丝状噬菌体复制起始con内单链DNA的合成;质粒在E.coli中的复制起始点(o(腼pr)用于原核细胞筛选;多克隆位点;多克隆位点两侧录起始点，使插入的外源DNA每一条链都能在体外进行转突出的T碱基，这一特点使载体和产物之间产生小的互补效果。

图3pGE卜4T一1原核表达载体图EX一4T一1原核表达载体:具有tac启动子;lac操纵基因;lac工肤昔肤琉基转移酶(GST)基因;原核细胞选择标志采用内酞胺因(Ampr)。ED、丙烯酞胺、N’N一亚甲基双丙烯酞胺;p一琉基乙醇(Sigm50(上海政翔化学试剂研究所);二氨联苯胺(DAB)(Roche公困C膜X北京益利精细化学品有限公司);PVDFWeste(Bio一Rad公司);proteinmarker(TaKaRa公司)。(鼠抗hTERT多抗血清)，二抗(HRI，标记的兔抗鼠IgG)。和常用溶液的配制一
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392

【共引文献】

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本文编号：2623616