可溶性血管内皮细胞生长抑制因子（VEGI）的克隆表达及功能研究

发布时间：2020-04-12 12:56

【摘要】：[背景] 血管内皮细胞生长抑制因子(VEGI)是1997年Tan等率先通过筛选人脐静脉内皮细胞cDNA文库发现的，因属于TNF超家族成员，当时命名为TL1(TNF-like ligand 1)。后因研究发现，VEGI_(174)的胞外区具有抑制内皮细胞增殖的作用，因此大多称之为VEGI。Chew等发现，VEGI全长基因为17Kb，由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个外显子和三个内含子构成。按不同的拼接方式拼接产生三种mRNA，分别编码由251、192、174个氨基酸残基组成的VEGI_(251)、VEGI_(192)和VEGI_(174)异构体。三者均含有Ⅳb外显子，其中VEGI_(251)和VEGI_(174)的C末端有151个氨基酸相同。目前，国内外对Ⅳb外显子编码的蛋白质的结构和功能研究较多。Zhai等研究发现，转染由IL-2的28个氨基酸残基组成分泌信号肽和可能的VEGI_(174)的胞外区构成的融合蛋白基因(sVEGI_(174))转染肿瘤细胞后能有效抑制肿瘤的生长，而将包括跨膜区的全长VEGI_(174)基因表达载体的转染到肿瘤细胞中不能有效抑制肿瘤的生长，说明只有VEGI_(174)的胞外区具有抑制内皮细胞生长的作用。 VEGI_(251)是由全长基因、4个开放读码框架编码的蛋白质，属TNF超家族成员，与TNF家族其他成员的氨基酸同源性最大为24.6％。与其他TNF超家族相同，VEGI_(251)为Ⅱ型跨膜蛋白，胞浆外C末端179个氨基酸残基组成其可溶性分子，组成其活性部分。生物活性的研究发现，VEGI_(251)是DR3和TR6／DcR3的TNF样配体，能诱导T细胞增殖和诱导红白血病细胞的凋亡等；而sVEGI_(174)具有诱导血管内皮细胞凋亡，激活JNK与P38MAPK等生物学活性，而且可以抑制新生血管生成从而抑制肿瘤的生长。尽管他们C末端结构相同，但其生物活性有较大的不同。本课题在我室对sVEGI_(174)的结构与功能及作用机制研究的基础上，克隆、表达了可溶性VEGI_(72-251)，并对其功能进行了研究。 [目的] (1) 从人脐静脉细胞中克隆VEGI_(251) cDNA的可溶性胞外区编码基因VEGI_(72-251)，长度为540bp； 5第二军医大学硕士学位论文 (2)将VEGI72.25，基因在大肠杆菌中进行诱导表达，并对表达产物进行纯 化; (3)研究可溶性VEG玩一251的生物学活性及其可能的作用机制: (4)可溶性vEGI72.2sl和s泥01:74的活性比较，分析可能的机制。 〔方法〕 (l)本研究用RT一PCR方法，从人脐静脉细胞总RNA中扩增可溶性VEG1251 胞外区(即VEGI72一1)的。DNA序列，用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，胶回收 目的基因片段，连接到pMD18一克隆载体中，转化大肠杆菌DHSQ，PCR和酶切 筛选阳性克隆，全自动DNA测序验证序列[2’]; (2)vEGI72一251亚克隆到nBV220表达载体中，转化大肠杆菌DHSQ，酶切鉴 定，阳性克隆用42℃热诱导表达，表达产物用SDS一PAGE分析和westem blot验 证; (3)重组蛋白质的纯化; (4)偶氮显色法检测样品的内毒素含量; (5)用体外培养的肿瘤细胞对表达产物进行活性检测122]，酶标仪测OD值; (6)鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成影响的检测123]; (7)用ELISA法检测VEGI作用pBMC24h后培养上清中IL一2和IFN，的含 量; (8)建立了C57小鼠种植B16细胞的肿瘤模型，采用此模型研究可溶性 VEGI25;对肿瘤生长的影响; (9)可溶性VEGI72_25;和sVEGI:7;的活性比较，分析可能的机制。 〔结果〕 (1)成功地从人脐静脉内皮细胞中克隆了可溶性VEGI251胞外区VEG玩一251 的基因，测序结果与文献一致; (2)可溶性VEGI251胞外区蛋白在大肠杆菌DHSQ中获得高效表达。SDS- PAGE分析表明，，蛋白质主要以包涵体形式存在于细菌中，经洗涤、溶解、复性、 DEAE阴离子交换柱和SephacryS一200层析柱纯化后蛋白质纯度约为94.5%。测 6第二军医大学硕士学位论文 定分子量约为20kDa，与预期大小一致。偶氮显色法检测样品的内毒素含量为 80EU/mg。Westem blot结果表明，该蛋白能与兔抗人sVEGll7;多克隆抗体特异性 结合。细胞活性检测结果表明，可溶性vEGI25;胞外区蛋白在(0~80p留ml)浓 度范围内对HUVEC、ECV3O4、Molt一4、B16等细胞的形态无明显影响，MTT法检测 细胞数量无明显改变。ELISA检测结果表明，可溶性VEG玩一51能刺激PBMC细胞 的工L一2和IF林分泌增多。C57小鼠种植B16细胞的肿瘤模型的研究表明，可溶 性VEGI72一25;不能抑制B16细胞在C57小鼠的生长。 〔结论〕 (1) vEGI72_25，胞外区在大肠杆菌中以包涵体的形式获得较高的表达，达菌 体总蛋白的25.6%; (2)VEGI72一251胞外区蛋白质经纯化后，纯度达到94.5%。经复性后具有明 显的生物学活性，可刺激T细胞IL一2和IFN丫分泌增多; (3)VEGI72一25一与sVEGI一科的生物学活性不同:虽然VEGI72一251胞外区C 末端的约146个氨基酸与sVEGll7;相同，但VEG玩一251不能抑制内皮细胞的和鸡 胚绒毛尿囊膜的血管生成，而sVEGll74则不能激PBMC细胞工L一2分泌增多。蛋 白质的氨基酸数量和增加或减少序列变化会改变蛋白质的空间结构，从而影响蛋 白质与相应配、受体的结合，改变蛋白质的功能l2’一26]。推测vEGI72_25，与T细胞 受体结合的结构位于其N端，N端增加的29个氨基酸残基具有与T细胞结合的 结构;而N端增加的氨基?
【图文】：

2一25:基因将vEGI72-251和VEGll。l一51的RT一PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，结果见图1一2:M2卜VEGI一01一2引图l一2人VEGllol二s，和VEGI72一251基因的RT一PCR扩增「19.1一2吓pCRampli月eationofhumanVEGllol一251andVEGI72一251.

39第二军医大学硕士学位论文500bP-刁卜~VEGI路”:图1一VEGI72一51的序列拼接琼脂糖凝胶电泳图Fig.1一4SPlieinggeneofVEGI7之一251M:DL2000DNAMar晚乓1:sPlieinggeneofVEGI左一252结果表明，序列拼接出的基因大小与预测的大小一致。将目的基因条带切下，进行胶回收，置一20℃冰箱保存。2.2鉴定人VEG玩一251基因以回收的VEG玩一25，基因条带与pMD18一T载体连接，将pMD18一T一vEGI72-251质粒转染DH5a后，用酶切法鉴定阳性菌，1.2%琼脂糖凝胶电泳检查，结果见图l一5。M123456‘00h一书一VEGI72.25-图l一5重组pMD一1ST一vEGI72一251质粒的酶切鉴定Fig
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

【参考文献】

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1 付生法,陆应麟,张朝山,陈坤;检测血管生长因子作用的鸡胚绒毛尿囊膜技术[J];军事医学科学院院刊;1993年04期

本文编号：2624741