鼠内皮抑素基因的克隆及表达

发布时间：2020-04-15 20:22

【摘要】： 肿瘤生长依赖于血管生成，新生血管为肿瘤提供氧气和营养，排出代谢废物。没有新生血管形成，肿瘤生长超不过几个立方毫米，并且肿瘤生长速度与血管新生程度有关。新生血管在肿瘤转移中也有重要作用，促进肿瘤细胞进入血液循环，血管生长丰富的肿瘤比缺乏血管生长的肿瘤更容易发生转移。因此抑制肿瘤组织的新生血管形成，从而抑制肿瘤生长和发生转移已成为肿瘤治疗的一个重要策略。肿瘤细胞不仅可产生促进血管生长因子，也能产生抑制血管生长因子，肿瘤生长受促进或抑制血管生长因子的共同调控。1997年O'Rilly首次从小鼠内皮细胞瘤培养液中分离出内皮抑素(endostatin)，氨基酸序列分析显示此蛋白是胶原ⅩⅧC末端的氨基酸片段，分子量为20KD。特异性蛋白水解酶降解胶原ⅩⅧ C末端的蛋白酶敏感区，产生内皮抑素。实验发现内皮抑素直接作用于血管内皮细胞，抑制血管内皮细胞增殖、迁移，具有强烈抑制血管生成活性。研究内皮抑素晶体结构显示其表面富含精氨酸残基，是肝素结合位点，此位点与其抑制血管生长的功能活性有关。许多研究表明重组内皮抑素特异性抑制内皮细胞增殖，而且这种抑制作用呈剂量依赖性。细菌表达产物内皮抑素大部分以不溶形式存在，将这种混悬液注射治疗老鼠仍可以抑制肿瘤生长。于小鼠皮下重复注射内皮抑素重组蛋白，几乎完全抑制鼠Lewis肺癌等多种肿瘤生长，并无耐药性产生，即使中断治疗肿瘤也不再复发。内皮抑素是一种很有潜力的抗肿瘤血管生成药物。本文进行小鼠内皮抑素基因的克隆及表达，基因工程方法构建了鼠内皮抑素的温敏型表达载体pBV220-endostatin，，为此作了以下工作： 1．从小鼠肝脏细胞中提取总RNA。设计合成一对特异引物，分别带有EcoRI和BamHI的限制性内切酶的识别位点。用RT-PCR法扩增endostatin的基因片段，在endostatin基因的两侧引入EcoRI和BamHI酶切位点。 2．用EcoRI和BamHI酶切endostatin cDNA的PCR产物，将其插入到质粒载体pBV220中相应的限制性酶切位点，构建非融合质粒表达载体pBV220-endostatin。 3.将重组质粒转化到克隆菌DH5a中，经PCR筛选和限制性内切酶鉴定，得到阳性克隆菌株。 4.以双脱氧末端终止法对重组质粒pBv220一endostatin进行测序，结果表明与己知小鼠endostatin基因序列一致。 5.温度诱导重组质粒pBv220一endostatin在宿主菌中表达外源蛋白。 6.用聚丙烯酞胺凝胶电泳检测表达产物，在20KDa处有一特异蛋白条带。 7.表达蛋白初步分离纯化。本文成功克隆鼠内皮抑素基因，构建了内皮抑素基因的原核表达载体 pBV220一endostatin，该载体为非融合性表达载体，将pBV22o一endostatin成功转化到大肠杆菌表达菌DH5a中，并诱导表达了鼠内皮抑素蛋白，为基因工程方法生产内皮抑素奠定一定基础。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：Q786

【参考文献】