PBDC1和NonO蛋白在红系分化过程中的功能研究及UPF0538蛋白的抗体制备

发布时间：2017-03-23 05:06

  本文关键词：PBDC1和NonO蛋白在红系分化过程中的功能研究及UPF0538蛋白的抗体制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细胞分化与去分化是生命科学领域中的一个研究热点,对其机制的研究为肿瘤的发生及防治提供重要依据。哺乳类红系细胞的分化具有明显的时序性变化,当细胞进入终末分化时出现:停止分裂、细胞体积逐渐减小、细胞核固缩、排核和特异蛋白-血红蛋白的表达等变化。小鼠胎肝是小鼠早期的主要造血器官,红系细胞在胎肝E10.5~E17.5造血过程中发生并完成终末造血过程,已成为研究体内红系分化的良好模型。此外,现已证实多种诱导剂能诱导红白血病细胞重新进入分化阶段,表达血红蛋白,这也是红系分化与癌变的另一个模型。在本实验室的前期工作中,利用差异蛋白质组学技术鉴定出丁酸钠诱导小鼠红白血病(Murine eryt hroleukemia,MEL)细胞向红系细胞分化过程和小鼠胎肝造血过程中有许多差异表达的蛋白质。其中既有一些已经有一定功能研究基础的蛋白质,例如:NPM1、P irin、RbAp48、NonO等;也有一些功能和高级结构未知的蛋白质,例如:PBDC1、UPF0538等。本文用细胞与分子生物学技术和方法研究PBDC1和NonO蛋白在红系分化过程中的功能,以及UPF0538蛋白的抗体制备。结果表明PBDC 1在MEL细胞和小鼠胎肝细胞中主要定位于细胞质,也有少量定位于细胞核。GS T沉降实验鉴定出159个PBDC1的潜在相互作用蛋白,其中有很大一部分肽酶和氧化还原酶,还有一些GTP结合蛋白、电子转移蛋白、铁离子结合蛋白,猜测PBDC1可能参与细胞内的氧化还原反应,电子转移,铁离子结合等过程,但需后续实验验证。此前,我们发现在SB诱导MEL分化过程中,NonO蛋白表达呈上调趋势,并且与红系负调控因子PU.1共定位,这说明NonO可能参与红系分化的调控。本文中为进一步研究NonO蛋白在MEL细胞分化中的作用,通过shRNA干扰方式构建了低表达NonO稳定细胞株。MTT比色法结果表明,NonO的低表达会抑制MEL细胞的增殖活力。Western blot鉴定结果表明低表达NonO蛋白会引起c-myc蛋白表达下调,而c-myc在调控红系分化方面有重要作用。由此可推测,NonO通过c-myc和P U.1调控红系分化过程。UPF0538是一个功能和高级结构未知的蛋白质,目前还没有商品化的抗体。为研究UPF0538在分化过程中的功能,我们利用原核表达系统获得大量的UPF0538融合蛋白,并以此免疫新西兰大白兔,制备了其多克隆抗体,为研究UPF0538的功能提供了基础。
【关键词】：红系分化 NonO PBDC 1 UPF0538 丁酸钠 小鼠白血病细胞 抗体制备
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392.11
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩略表8-12
• 第一章 绪论12-17
• 1 研究背景、目的及意义12-14
• 1.1 研究背景12-13
• 1.2 研究目的及意义13-14
• 2 NonO蛋白的研究现状14-15
• 2.1 NonO蛋白的发现14
• 2.2 NonO蛋白亚细胞定位与功能14-15
• 3 PBDC1和UPF0538的研究现状15
• 4 技术路线15-17
• 第二章 PBDC1和NonO蛋白在红系分化过程中的的功能研究17-57
• 1 前言17-18
• 2 材料与方法18-39
• 2.1 材料、试剂及实验仪器18-22
• 2.1.1 细胞、菌株和质粒18
• 2.1.2 主要试剂18-20
• 2.1.3 主要仪器20
• 2.1.4 主要试剂配制20-22
• 2.2 实验方法22-39
• 2.2.1 Westernblot检测PBDC1在MEL细胞分化中的表达情况22-23
• 2.2.2 Westernblot检测PBDC1在小鼠胎肝E11.5~E15.5 的表达情况23
• 2.2.3 免疫细胞化学实验检测PBDC1在MEL细胞的亚细胞定位23-24
• 2.2.4 免疫细胞化学实验检测PBDC1在小鼠胎肝细胞中的定位24
• 2.2.5 细胞培养24
• 2.2.6 细胞总RNA的提取24-25
• 2.2.7 RNA的反转录25
• 2.2.8 PBDC1 基因的引物设计25
• 2.2.9 PBDC1 基因的克隆25-26
• 2.2.10 表达载体pGEX-4T1PBDC1的构建26-30
• 2.2.11 PBDC1融合蛋白的表达30-31
• 2.2.12 GST-Pull Down实验鉴定PBDC1的相互作用蛋白31-33
• 2.2.13 干扰载体pLKO.1-NonO-shRNA的构建33-37
• 2.2.14 慢病毒的包装37-38
• 2.2.15 低表达NonO的MEL细胞稳定株的建立38
• 2.2.16 Westernblot验证低表达NonO的MEL细胞稳定株38-39
• 2.2.17 Westernblot验证低表达NonO对红系相关蛋白表达的影响39
• 2.2.18 MTT比色法检测低表达NonO对MEL细胞活力的影响39
• 3 结果39-55
• 3.1 PBDC1在 红系分化中的表达变化39-40
• 3.1.1 PBDC1 在丁酸钠诱导MEL细胞分化中的表达情况39-40
• 3.1.2 PBDC1 在E11.5~E15.5小鼠胎肝的表达情况40
• 3.2 PBDC1的细胞定位40-42
• 3.2.1 PBDC1在MEL细胞中的定位40-41
• 3.2.2 PBDC1在小鼠胎肝细胞中的定位41-42
• 3.3 表达载体pGEX-4T1P BDC1的构建42-44
• 3.3.1 PCR扩增PBDC1基因42-43
• 3.3.2 重组质粒pGEX-4T1PBDC1的鉴定43-44
• 3.4 PBDC融合蛋白的诱导表达44-45
• 3.5 GST-Pull Down鉴定PBDC1相互作用蛋白与验证及生物信息学分析45-52
• 3.5.1 PBDC1 相互作用蛋白的鉴定45-50
• 3.5.2 GST-Pull Down结果验证50-51
• 3.5.3 PBDC1 相互作用蛋白生物信息学分析51-52
• 3.6 干扰载体pLKO.1-NonO-shRNA的鉴定52-53
• 3.6.1 干扰载体pLKO.1-NonO-shRNA的酶切鉴定52
• 3.6.2 干扰载体pLKO.1-NonO-shRNA的测序鉴定52-53
• 3.7 病毒包装时转染效率的检测53
• 3.8 低表达NonO的MEL细胞稳定株的筛选及鉴定53-54
• 3.9 低表达NonO对MEL细胞活力的影响54-55
• 3.10 低表达NonO对红系相关基因表达的影响55
• 3.12 低表达NonO对丁酸钠诱导MEL细胞分化的影响55
• 4 讨论55-57
• 第三章 UPF0538蛋白的抗体制备57-69
• 1 前言57
• 2 材料与方法57-65
• 2.1 实验材料、试剂及仪器57-59
• 2.1.1 菌株及质粒57
• 2.1.2 实验动物57
• 2.1.3 试剂57-58
• 2.1.4 仪器58-59
• 2.1.5 主要试剂的配制59
• 2.2 实验方法59-65
• 2.2.1 重组pET-28a(+)-UPF0538质粒的构建59-62
• 2.2.2 重组pET-28a(+)-UPF0538质粒的鉴定62-63
• 2.2.3 UPF0538蛋白的表达、纯化及鉴定63-64
• 2.2.4 UPF0538多克隆抗体的制备、纯化及鉴定64-65
• 3 结果65-68
• 3.1 PCR扩增UPF0538基因65
• 3.2 重组质粒pET-28a(+)-UPF0538的鉴定65-66
• 3.2.1 重组质粒pET-28a(+)-UPF0538的酶切鉴定65-66
• 3.2.2 重组质粒pET-28a(+)-UPF0538的测序鉴定66
• 3.3 UPF0538蛋白的表达及可溶性分析66-67
• 3.4 UPF0538蛋白的纯化及鉴定67-68
• 3.5 UPF0538多克隆抗体的Western blot检测68
• 4 讨论68-69
• 第四章 结论和展望69-70
• 1 结论69
• 2 展望69-70
• 参考文献70-74
• 致谢74-75
• 攻读学位期间的研究成果75

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