纳米颗粒标记膜层析快速检测HCV试纸的初步研制

发布时间：2020-04-19 15:31

【摘要】：纳米科学技术(Nano-ST)是20世纪80年代末期诞生并正在崛起的新科技，它的基本涵义是在纳米尺寸(10~(-10～)10~(-7)m)范围内认识和改造自然，通过直接操作和安排原子、分子创造新物质。纳米材料作为一种材料的定义把纳米颗粒限制到1-100nm的范围，实际上广义地讲纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围或由它们作为基本单元构成的材料。丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，简写HCV)是一种广泛传播的血源性病毒，是输血引发的非甲非乙型肝炎的主要致病因子，在我国人群中的感染率约为2％，且与许多原发性肝癌、肝硬化、自身免疫性肝炎以及暴发性、病毒性肝炎均有密切关系。由于目前尚无治疗HCV感染的特效药物，所以对HCV的感染者进行早期检测，防止其经血或其它途径传播，是目前阻断HCV传播、降低HCV感染率的主要途径。目前针对抗HCV抗体的检测手段主要包括以下三类：酶免疫法(EIA)；重组免疫印迹试验(RIBA)；多聚体肽(MAP)。另外还有分别针对HCV RNA和HCV抗原的检测。但相对检测抗体来说，检测HCV RNA和HCV抗原在实际应用中都还面临着一定的困难。酶免疫法检测抗HCV抗体是目前最常用的方法，可作为筛选献血者及疾病诊断的手段。这一方法的改进主要表现在使用不同的抗原，以提高诊断的灵敏度及特异性。尽管目前主要采用的重组抗原或合成肽抗原检测试剂有长足的发展，但这些试剂仍存在一定的缺点。嵌合抗原则兼备重组抗原和多聚体肽的优点，它去掉了不与抗体结合的无关序列，涵盖来源于HCV基因组和型特异区的优势表位，克服了基因型差异对抗体检测的影响，提高了检测灵敏度和特异性。我们通过分析HCV结构区、非结构区蛋白的氨基酸序列以及查阅相关文献，克隆表达了包含整个HCV基因序列中优势抗原决定簇位点的蛋白。经纯化后，可获得较纯的嵌合抗原。酶免疫法在使用中既需要专门的仪器设备，又必需有专业人员操作，且操作复杂费时。在野战条件下的血液保存与检测已成为新时期军队后勤建设的极其重要课题的今天，酶免疫法已远远无法满足现代高科技战争的要求。它同样也无法硕士学位论文纳米颗粒标记膜层析快速检测抗HCV抗体试纸的初步研制实现患者的家庭自检。这些都需要我们建立一种新的简便、快速、容易判读结果的HCV检测方法。免疫层析是出现于20世纪80年代初期的一种独特的免疫分析方式。它无需进行结合标记物和自由标记物的分离，省去了烦琐的加样、洗涤过程，且不需或仅需简单的仪器。免疫层析快速简便的特点使其在战场野外条件、各级医院门急诊检验及家庭、个人保健等方面得到了广泛的应用。基于上述目的，我们用克隆得到的丙型肝炎病毒嵌合抗原，应用膜免疫层析技术初步研制出既可用于战时血液质量鉴定又可在平时HCV感染筛查中发挥作用的快速检测抗HCV抗体试纸。免疫层析试纸要求在质控线包被可以和免疫层析标记复合物结合的相应物质。根据此项要求我们用克隆得到的HCV嵌合抗原免疫家兔，抽取兔血制备了针对HCV 嵌合抗原的多抗血清。经蛋白G柱纯化后效价为1:102400，SDS一PAGE显示纯化取得了理想的效果。为进一步的应用奠定了基础。找到一个合适的免疫层析标记物是进行一项免疫层析实验的前提。我们遵循以下原则对三种纳米材料进行了筛选:(l)制备方法是否简便易行;(2)制备得到的颗粒是否稳定;(3)颗粒标记我们的目的蛋白的过程是否简单，标记效率是否较高;(4)颗粒可选择的粒径范围是否能够满足我们的需要;(5)形成产品后要有明显易判读的显色反应;(6)经济性要好。最终确定以胶体硒作为我们下一步实验理想的标记物。硒是一种人们早己熟悉的稀土元素，其黑色元素硒和灰色元素硒几乎没有任何生物活性和毒性。现在在免疫层析中应用的是红色元素硒。我们在世界上第一次利用冷法合成出了单质红色纳米颗粒硒，并已申报专利(专利号:02129360.0)，且在国内首次将这种纳米颗粒硒应用于免疫层析试纸中。为筛选出适合我们实验的层析材料，我们对多种可用于免疫层析的硝酸纤维素膜的重要物理学性质，如流速、流动的均匀性和背景残留等进行了比较，最终确定了适合我们实验的NC膜。通过对不同HCV嵌合抗原标记包被缓冲液、不同标记pH缓冲环境和不同标记抗原用量实验，确定了PBS+0.01%SDS为HCV嵌合抗原最佳标记、包被缓冲液，建立了pHS.5，lml胶体硒比sug抗原的标记标准方案。通过对层析膜不同的抗原包被量、不同的封闭条件和层析时不同胶体硒标记复合物用量的实验，确定了每条试纸的最适抗原包被量为1.sug，筛选出 Zry0PVP+O.5%Tween一20、室温、smin的封闭条件和6ul为最佳标记复合物的用量。在上述实验基础上，我们利用相关机械设备，制成HCV试纸的工业化半成品。通过各20份的HCV阴、阳性血清对自制试纸进行了初步评价。基本完成了本试纸的初步研制工作，为下一步规格化，，实用化，工业化生产打下了良好的基础。
【图文】：

抗HCV,多克隆抗体

SDS一PAGE鉴定抗体纯度。实验结果AKTA蛋白纯化仪280NM监测图如图1.1所示。G蛋白是G群链球菌的细胞表面蛋白，是一类S型FC受体，结合在工gG的FC区域。蛋白G对工gGF。段在中性pH环境有特异性结合力，改变pH则结合力下降而洗脱出抗体。纯化并浓缩后的抗体经ELISA测定效价达到1:102400。图1.1抗HCV多克隆抗体纯化280NM监测图注:ACDEGH工为上样峰;BFJ为甘氨酸洗脱峰

多克隆抗体

纳米颗粒标记膜层析快速检测抗HCV抗体试纸的初步研制电泳结果如图1.2，显示有两条带，分别在约24KD和51KD位置。经透析及浓缩后在紫外分光光度计上测定抗体在280nm和26Onm波长紫外光下的吸光度值，计算后测得抗体浓度为IOmg/m1，完全符合我们的要求。图1.2多克隆抗体SDS一PAGE结果注:Marker自上向下分子量为97.4KD、66.ZKD、43KD、31KD、20.IKD、14.4KD，多抗电泳结果，两条带位置分别在约24KD和51KD讨论抗体通常是从血清或腹水中获得的。尽管直接使用上述未纯化的抗体溶液也可以进行一些免疫学实验，但要在免疫层析实验中获得满意的结果则要求我们制备纯化的抗体。虽然传统的硫酸钱沉淀的方法也可以用来纯化抗体，但由于硫酸钱沉淀法纯化后的抗体纯度不高
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392

【引证文献】