抗丙型肝炎病毒锤头结构核酶抑制基因表达的研究

发布时间：2020-04-19 01:03

【摘要】：丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起，主要通过血源传播的一种世界性传染病。流行病学资料表明，HCV感染呈全球性分布，在西方国家的普遍人群感染率为1％，我国高达3.2％。目前全世界至少有1亿人携带HCV，每年约有1百万新的HCV感染者。HCV感染后，约有50-80％的感染者发展为慢性肝炎，在此基础上约25％的患者最终演变为肝硬化，并与肝细胞癌(HCC)的发生密切相关。HCV基因组变异率高，病毒准种多，目前尚无有效的抗病毒治疗药物。核酶(Rz)是一类具有酶活性的RNA分子，可序列特异性地结合并切割靶RNA，从而阻断靶基因的复制和表达。锤头结构Rz分子较小、结构简单、易于设计合成，作为新的抗病毒治疗手段，已在多种病毒的基因治疗研究中显示出潜在的应用价值。本研究选择高度保守的5’NCR和C区为靶序列，在体外设计合成两个锤头结构Rz，研究Rz在体外对靶RNA的切割作用和在细胞内对HCV基因表达的抑制作用。同时探讨建立带荧光素酶(luc)报告基因的四环素调控性细胞模型的方法。主要研究内容如下： 1 根据锤头结构Rz的设计原理，以HCV-H株基因序列为靶，通过对靶RNA二级结构的能量分析，在HCV 5’NCR和C区选择出213、260、470和478四个理想的靶位点，设计出Rz的基因序列。为了解这4个Rz的“广谱性”，分析比较了具有代表性的5株HCV序列，其Rz切点两翼碱基(7-8nt)的同源性为100％。 2 选择针对5’NCR的213和260两位点，在体外合成Rz213和Rz260单链基因，通过亚克隆技术将Rz基因插入两端带有自剪切Rz的pGENE8459v3载体，然后重组在pcDNA3真核表达载体的CMV启动子下游。酶切鉴定结果表明，我们所构建的体外转录载体(pGEM-Rz)、自剪切亚克隆载体(pGENE-Rz)和真核表达载体(pcEM-Rz和pcENE-Rz)的连接正确。为了保证Rz序列的正确性，对pGEM-Rz213进行了手工测序，结果与设计合成的Rz序列完全一致。 3 应用α-~(32)P-UTP在体外标记靶RNA，通过放射性自显影方法检测体外转录Rz对靶RNA的切割作用，结果表明Rz213和Rz260均可位点特异性切割靶RNA。 4 通过脂质体(lipofectamine)介导的细胞转染，将Rz基因真核表达载体导入体外
【图文】：

抗病毒免疫,非结构蛋白,结构蛋白,黄病毒科

有的免疫应答产生免疫逃逸，或出现缺损病毒(deefctivevi应答效应。2)准种特性。即HCV以一种主要株和多个与之群方式存在于患者体内l’2]。3)病毒的低水平复制。在受HC滴度极低，估计约为100个加[l’3】，如此少的病毒含量，可强度的抗HCV免疫反应。4)损伤机体免疫系统卿，’0l，HCV响其抗病毒免疫作用的发挥。5)机体抗病毒免疫不足或免子之间协调不够，，并可能与HLA系统有关。组RNA的结构和功能组的大小、结构和病毒复制酶等与黄病毒(flvaviiruses)和es)s相似，现已将其归为黄病毒科的一个新属t川。目前的研V是一单股正链RNA病毒，整个基因组长度约.94kb，由区(NCR)和一个大的开放读码框架(openreadingrfmae，o氨基酸的多聚蛋白(polPyrotein)，在细胞蛋白酶或病毒蛋白酶性基因产物，即结构蛋白和非结构蛋白6]I。结构蛋白有核心白(E蛋白)，非结构蛋白包括NSZ、NS3、NS4A、NS4B、HCV基因组结构、多蛋白的加工过程及其功能见图1和表1

二级结构,计算机模拟

医大学博士学位论文博士生贾战生导师周永兴教码区(nonoeodingergion，NCR)ev基因组的5’端和3’端各有一NCR(也称非转录区uninarsplatingerg核昔酸序列分别为5’NCR约324一34lbp，3’NeR27一55bp。该区的大V的来源和基因型的不同。CR在HCv基因组中5’NCR最为保守，是PcR诊断试剂、基因分型治疗选择的理想靶序列。与一般病毒不同，HCVS’NCR内部含有多这些小的O盯是否能表达或履行某种功能目前尚不清楚[’7]。此外，在H发现了三个高度保守的结构域(domains)，它们分别位于该区的3一65、6一263位[45]。前两个结构域可能与HCV的进化有关，第三个结构与对H翻译至关重要1261。对来自全球范围内12个国家的44份血样作序列测该区的同源性在90%以上，与HCV基因型多、易变异的特点形成鲜NCR的二级结构模式由Borwn等{49}首先提出，后得到了不同研究结rown将HCvs’NCR与几株瘟病毒的5’NCR序列和热力学模型相比较，机分析，模拟出5’NCR的二级结构模式图2。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：1998
【分类号】：R346

【参考文献】