阴道毛滴虫Prx系统的基因克隆及其功能分析

发布时间：2020-05-06 14:10

【摘要】：背景与目的 阴道毛滴虫系最早期的单细胞真核生物之一，没有线粒体，，但有氢酶体，能量代谢方式主要为糖酵解，并能适应在低氧环境下生长。在自然条件下，毛滴虫细胞是暴露于氧气中的，尽管有人认为低氧有利于毛滴虫的生长，但一般认为氧气是该细胞生长的不利因素。例如：活性氧本身就可以灭活虫体的活性酶，尤其是氢酶体的一些重要蛋白；氧代谢可以产生一些对细胞有害的过氧化氢、羟基等自由基。毛滴虫主要依靠胞浆内的NADH氧化酶将氧还原成水和NADPH氧化酶将氧还原为过氧化氢的作用来防止活性氧向氢酶体的渗透和损伤。由于毛滴虫缺乏其它真核细胞所具有的CAT、GSH及GPx，那么它是如何清除由NADPH氧化酶及SOD所产生的过氧化氢等活性氧(ROS)的呢? 最近越来越多的研究发现在细菌、酵母及动、植物中存在另外一种抗氧化酶过氧化物氧化还原酶(Prx)。Prx是一类硫氧还蛋白(Trx)依赖性酶，需要Trx作为还原剂，而氧化型的Trx则由硫氧还蛋白还原酶(TrxR)还原。Prx具有还原过氧化氢、烷基过氧化物等作用，因而可以防止ROS对细胞的损伤。Prx除了具有抗氧化作用外，也可以充当第二信使，通过信号转导调节细胞的增殖、分化和凋亡。对真核细胞中包括寄生虫(锥虫、蠕虫、恶性疟原虫)在内的Prx研究较多，但是缺少对无线粒体的真核细胞如溶组织内阿米巴、贾第鞭毛虫和阴道毛滴虫Prx的功能认识。本研究通过构建阴 必决又梦g梦君礴公斗忿犷书尹奋丈 道毛滴虫cDNA表达文库，筛选分离出Trx和Prx等。DNA克 隆，并研究该系统在阴道毛滴虫中的抗氧化作用及对细胞周期 的影响，为探索原生动物衰老的基因调节通道奠定基础。 材料和方法(1)提取阴道毛滴虫的总RNA，分光光度计测定 RNA的浓度然后变性凝胶电泳鉴定RNA的纯度。 (2)反转录酶合成cDNA一链，LD PCR合成和扩增。DNA二 链，Sfil酶切纯化，植入和包装噬菌体，转染细菌并进行扩增， 蓝白斑测定文库的滴度和重组率。 (3)挑取300个分界良好的噬菌白斑，转导入E.coli BM25.8 菌中，碱裂解法提取质粒作为PCR扩增模板，根据克隆载体序 列，设计一对引物，电泳鉴定插入片段的大小，采用Sanger双 脱氧链末端终止法对插入片段进行测序，并对测序结果进行序 列分析和同源性比较。 研究结果(1)按试剂盒提取总RNA 35时，紫外测定核酸含量 为653卜g/ml，A260/A280=1.98，用l%变性琼脂糖凝胶电泳鉴 定，总RNA的1 85和2 85二条带清晰，未见降解。 (2)取扩增出的cDNA双链与人胎盘细胞总RNA经同步扩增 后的双链各5川进行琼脂糖电泳分析，结果出现0，2一4kb的瀑 布状拖带，证明滴虫的cDNA分子大小分布正常、完整;根据 平板上1:10，1:40，1:100不同稀释度的噬菌斑数估计初始文库 的包装效率为6.78XI护pfu/ml，而文库扩增后的效率为1.68X 109 pfu/ml，经蓝、白斑测定文库的重组率98%。 (3)插入片段大小在500一2300bp之间，平均为150obp，分离 出相关基因的eDNA克隆如Trx、Prx、Ras及SIRZ等。序列分 析发现Prx所编码的肤链与衣滴虫过氧化物氧化还原酶(Prxl 蛋白)及人的自然杀伤增强因子B分别有56%和61%的同源性; 除了两个高度保守的半肤氨酸和蛋白激酶C磷酸化等作用基序 外，还有特有的脂质运载蛋白信号位点及免疫球蛋白/主要组织 泌关又梦硬梦觉礴公斗君犷书鸿奋丈 相容性复合体蛋白信号位点。分离出两个新的阴道毛滴虫Trx 都有催化氧化还原反应的高度保守序列WCGPC、疏水区以及参 与蛋白结合的结构等。 结论(1)成功构建阴道毛滴虫cDNA表达文库，并从中分离 相关基因如Trx、Prx、Ras及SIRZ等eDNA克隆。 (2)Prx蛋白有56%以上可能位于胞浆，与典型的2一Cys Prx 亚家族有很高的同源性，是其中的一个新成员;分离出另外两 个新的阴道毛滴虫Trx基因。
【图文】：

一18虫中提取的总RNA:1RNA.RNAisolatedfrom刃.ind111maker，laneZ，t建第二链与人胎盘细胞总5川进行琼脂糖电泳分2)，证明滴虫的cDNA分，卜丙bP

必决又矛硬梦君礴必布忿对定:10，1:40，1:100等不同稀释度平板上的噬的包装效率为6.78x106pfu/ml，而文库扩109pfu/ml，经蓝、白斑测定文库的重组率>G和x一gal的平板上挑取分界良好的噬菌白25.8菌中，提取DNA作为模板进行PCR糖凝胶鉴定，结果片段大小在500一2300bpp(图3)。用引物InsR和/或InsF作为测序脱氧链末端终止法对插入片段进行测序，列分析和同源性比较。如
【学位授予单位】：汕头大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

【共引文献】

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本文编号：2651392