TRAIL分子胞外段克隆表达及其凋亡效应的初步研究

发布时间：2020-05-07 00:52

【摘要】：TRAIL为Ⅱ型跨膜蛋白，属于TNF家族分子。它可诱导某些敏感细胞的凋亡，包括肿瘤细胞与转化细胞。尽管TRAIL与其它TNF家族分子如TNF-α、FasL等在结构上存在同源性，但功能上却有很大差异，主要表现在它选择性诱导多种肿瘤细胞的凋亡却保护大多数正常细胞免于受损，突破了TNF-α、FasL等分子在体内应用的局限性。 本研究构建人TRAILcDNA的真核表达载体，对TRAIL分子的凋亡效应进行初步研究。 通过高保真聚合酶链式反应(PCR)方法扩增带有人TRAIL114～281aa的基因片段。随即将目的片段连入pGEX-6p-1，经过酶切与测序证实扩增得到的DNA的正确性。重组表达载体pGEX-6p-1-TRAIL在大肠杆菌表达系统中进行IPTG诱导表达，将表达产物免疫小鼠，制备多克隆抗血清。将经过DNA序列测定后的人TRAILcDNA克隆进真核表达载体pcDNA3，真核重组表达载体pcDNA3-TRAIL经脂质体介导转染CHO细胞，间接免疫荧光检测到人TRAIL在CHO细胞中的表达。采用MTT法和Annexin V-FITC法及流式细胞仪技术测定重组TRAIL对7402肝癌细胞的抑制活性。将7402肝癌组织移植于裸鼠皮下，建立裸鼠皮下肿瘤模型，构建了真核表达载体pcDNA3-TRAIL，对建立的皮下肿瘤模型进行治疗。 DNA序列测定结果显示：克隆的人TRAILcDNA与文献报道基本一致。SDS-PAGE电泳结果显示，人TRAILcDNA可以在大肠杆菌表达系统中表达。间接免疫荧光显示转染后的CHO细胞的胞浆内有目的蛋白的表达。MTT和流式细 胞仪结果显示重组TRAIL在体外可抑制7402肝癌细胞的生长，凋亡率可达31%， 治疗结果显示，克隆的人TRAILeDNA可以在小鼠体内表达，达到抑制7402肝癌 细胞在裸鼠体内的生长。本研究成功克隆并表达了人TRAIL，可以用来对裸鼠皮 下肿瘤模型进行治疗。
【图文】：

TRAIL的受体示意图

一一一一一一一一一一一进巡塑巡兰l2出置于一20℃。克隆策略见图1。图1:pGEx一印一1一TRAIL克隆策略1.5.3大肠杆菌感受态细胞的制备参照《分子克隆实验指南》所介绍的方法进行，，简述步骤如下:从划线培养的LB平板上挑取单个BLZI菌落，接种于5而LB培养基中，37℃摇震培养过夜，次日以1:100转接种于lomlLB培养基中，37℃250印m培养2小时，将其置于冰水混合物中10分钟，10O0rpm离心5分钟;去上清
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：Q786

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 柳湘,田培坤,顾健人;联合基因治疗肿瘤研究新进展[J];国外医学(肿瘤学分册);2000年05期

2 方成,陈钧辉;细胞凋亡与癌症治疗[J];中国生化药物杂志;2000年06期

本文编号：2652145