重组人白细胞介素10的融合表达及功能学初步研究

发布时间：2020-05-09 09:18

【摘要】：目的：白细胞介素10(interleukin 10，IL-10)是由单核-巨噬细胞分泌的一种蛋白质，相对分子质量约为21000Da。IL-10具有多种生物学活性，是一种多功能细胞抑制性因子，可抑制单核—巨噬细胞、T淋巴细胞等炎症细胞的激活及多种炎症因子如IL-1β，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，IL-6，IL-8，IL-12等的合成，在炎症免疫反应，肿瘤，病毒感染，造血系统，心血管系统等多方面发挥着重要的作用。本实验构建表达人重组白细胞介素10(recombinant human interleukin 10，rhIL-10)融合蛋白分子，通过Ni柱进行亲和层析，获得一步纯化的表达产物，为进一步研究IL-10在临床疾病应用中的作用机制奠定基础。 方法： 1、应用RT-PCR方法扩增IL-10基因，克隆PCR产物，构建hIL-10重组质粒，以AppiedBiosystems 3700 DNA分析仪进行分析。采用构建成功的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLyse细胞，12％SDS-PAGE和免疫印迹鉴定融合表达蛋白。 2、离心分离包涵体(IBs)，将IBs溶于7M尿素中，然后通过Ni柱进行亲和层析，以获得一步纯化的表达产物，纯化产物稀释复性。 3、以外周血单核细胞为研究对象观察纯化产物重组人IL-10对外周血单核细胞分泌TNF-α的抑制作用。 结果： 1、用RT-PCR方法扩增IL-10基因，成功构建IL-10质粒，此质粒在BL21(DE3)pLyse中得到高效表达。 2、rhIL-10经Ni柱纯化后纯度为80.42％、回收率为66.72％。 3、对重组IL-10与TNF-α之间的关系的研究表明，随着重组IL-10浓度的增加，单核细胞分泌TNF-α的含量逐渐减少，并且与对照组相比差异存在显著性，表明IL-10可抑制TNF-α的分泌。 结论：成功构建重组hIL-10质粒载体，并在大肠杆菌BL21(DE3)pLyse细胞内高效表达。纯化样品经稀释复性后，对单核细胞分泌致炎因子的功能有抑制作用。
【图文】：

1%琼脂精报胶电泳鉴定重组质粒，结果见图2。图2质粒ON^蔺切图诺1.609bpPcR产物2.重组IL-10cDNA双酶切片段3.中X174H创姆mDNA标准4.入一H初LdlllDNA标准

含重组质粒的BL21(DE3)pLyse细菌培养液经IPTG(1mM)分别诱导培养不表达融合蛋白，12%SDS一PAGE电泳结果见图3。凝胶图象分析系统对电泳图果为诱导0，1，2，3，，4h融合表达的rhIL一ro占总蛋白的含量分别为10.99%，.77%，35.73%，45.02%。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392.1

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本文编号：2655922