重组真菌细胞色素P450nor2的表达纯化及多克隆抗体的制备

发布时间：2020-05-09 15:07

【摘要】：细胞色素P450是一类能与CO结合，形成的复合物在450nm附近具有最大吸收峰的血红蛋白的总称。细胞色素P450nor是一类独特的细胞色素P450，它在真菌反硝化中扮演着重要的角色。P450nor起着一氧化氮还原酶的作用，能以NAD(P)H为直接电子供体将NO还原成N_2O。虽然它属于P450超家族，但没有加单氧酶的活性。迄今为止，已从真菌和酵母中克隆了多种P450nor基因，表明其存在的普遍性。本研究将真菌细胞色素P450nor基因克隆到高效表达载体pET-28的BamH Ⅰ／HindⅢ位点，得到重组原核表达质粒pET-p450nor，转化大肠杆菌BL21菌株，经IPTG诱导获得高效表达真菌细胞色素融合蛋白His-P450nor。SDS-PAGE蛋白电泳表明在43kD处出现强特异带。His-Tag柱在2.5h内一步纯化可溶性融合蛋白20.8mg，，纯化融合蛋白注射雄性新西兰大白兔可诱导产生特异性抗体。Westernblot和ELISA检测结果显示，该抗体与表达的融合蛋白呈阳性反应，效价在64，000以上。纯化的融合蛋白His-P450nor能通过催化NO来抑制肿瘤细胞SSMC-7721肿瘤细胞的生长。 利用Bac-to-Bac杆状病毒载体表达系统将真菌细胞色素P450nor基因克隆到转移载体pFastBacl中，构建重组质粒pFastBac-P450nor。再将其转化进入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中发生转座作用，得到含P450nor基因的重组穿梭载体rBacmid pAc-P450nor。分离提取重组Bacmid DNA，并转染培养的昆虫细胞Sf9，得到重组病毒rAc-P450nor。经酶切和PCR鉴定，细胞色素P450nor基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下。SDS-PAGE分析证明：表达蛋白的分子量为43kD左右。Western blotting分析结果表明：有一条特定的杂交带存在，且分子量相同(约43 kD)。进一步证明了含有真菌细胞色素P450nor基因的重组表达载体和重组病毒构建成功，并在昆虫细胞Sf9中实现了高效表达。经MTT法测定表达的细胞色素P450nor具有还原NO的生物学活性。
【图文】：

回收P4SOnor基因片段，同时回收命扭厅I/Hz’刀d工H双酶消化的原核表达质粒载体pET28，然后将回收的P450nor基因片段分别与载体pET28用T4DNA连接酶连接，构建成重组表达质粒pET一P450nor(图1，图2)。表达质粒pET一28a、b、C是一套含有不同阅读框的表达质粒，分别长5369、5368、5367bP。带有Kan抗性基因、T7启动子、T7终止子、七ac工调控基因和多克隆位点。这两种质粒都可以很方便地克隆任一外源基因，使其与T7启动子启动的细菌蛋白编码区引导序列同框，并且紧靠T7启动子引入了6个His的编码序列，这样，表达的融合蛋白在N端带有6个His，可以通过鳌合镍离子亲和层析柱快速纯化表达蛋白，有利于表达蛋白的分离纯化和功能研究。3.1.2重组表达质粒pET一P450nor的鉴定构建的重组表达质粒pET一P45Onor转化大肠杆菌BL21，用Kan平板筛阳性克隆

500，250，功O2:命盈厅I/H1’nd111酶切鉴定pET一P450nor3:PET一P450nor32;42.0以打肠430-1l.0月Jf‘图3!l峨4P450nor蛋白纯化前后的SDS一PAGE分析:Ni一NTA
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：Q785

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