HLA配型新策略：融测序与构象于一体的RSCA系统的建立及在HLA-A、B位点中的临床应用研究

发布时间：2020-05-10 10:42

【摘要】： 毋庸置疑，异基因造血细胞移植是治疗多种造血系统恶性病、遗传性疾病、重症联合免疫缺陷病以及重度放射病等顽疾的有效方法之一，而供-受体主要组织相容性抗原(HLA)相合与否是移植成败的关键因素。随着我国独生子女的不断成长与增多以及骨髓库和脐血库的相继建立，非亲缘供-受体造血细胞移植无疑将是今后临床造血细胞移植的必然趋势。大量资料表明，HLA不完全相合造血细胞移植的排斥率、死亡率和GVHD发生率均明显高于HLA完全相合的供-受体移植，而且移植后患者免疫功能的重建缓慢，致命性感染机会增加。因此，移植成功的重要前提是要对供-受者HLA进行精细的分型。然而，由于人类HLA的高度复杂性、多态性(polymorphism)和多样性(diversity)，建立一种准确、快速、简便、灵敏、特异、高分辨、低成本和高通量的HLA分型系统则已成为亟待解决的重要问题。我们知道，迄今为止HLA系统共发现1620个等位基因，其中仅A位点就有266个等位基因，B位点有511个等位基因，DRB位点有403个等位基因。目前，国际上应用最为广泛的HLA基因分型方法是PCR-SSP技术，这是一种成熟、快速而且比较准确的分型方法。但由于PCR-SSP方法只能对已知基因序列进行引物设计，而对于未知的等位基因则无法判定，这就必然会造成分型的结果错判或误判，尤其是会漏检新的等位基因，再加上其分辨率较低、检测标本规模较少和成本较高等缺陷，远不能满足当今临床上移植应用的需要。而融构象与测序于一体的参照链介导的构象分析(reference strand mediated conformation analysis, 早祥霭阵吕受驾冷才泣卜驾冷店乞石i反d匕驾冷毛立‘翻全二了匕 RSCA)系统的出现则能较为圆满地解决这些不足。 RSCA分型策略的基本原理是利用HLA位点特异性引物PCR扩增不同等位基因，然后与Cys标记的荧光标记参照链进行杂交，根据杂交双链的空间结构不同所致在非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳中的迁移率不同，通过激光扫描可检测并记录各条荧光标记杂交双链在凝胶中的迁移率，最后根据已知的RSCA数据库对各等位基因进行型别指定。该分型系统不仅能鉴定出既定位点所有的已知等位基因，而且还能发现未知的新等位基因;在实验中可根据不同位点的多态性情况来选择不同数量的荧光标记参照链，如对HLA一A位点来说选择2条参照链就可将其所有的等位基因区分开来;而对多态性最多和最复杂的HLA一B位点来讲，则需选择三条荧光标记参照链，从而达到高分辨率的目的;此外还具有高通量检测的特点，如本研究所采用的为非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳，一次可上样18个HLA一A位点或 12个HLA一B位点样品;由于在每一电泳样品中均需加入杂交双链Marker，以及在选定的1、14、27和40四条泳道中均加入杂交双链Ladder，这就确保了在同一凝胶中不同泳道间与不同凝胶间电泳结果指定的统一性，消除了不同泳道和不同凝胶间电泳迁移率的误差，使实验的准确性和重复性得以提高;最可取的是，通过激光检测仪扫描电泳条带，能自动记录各电泳条带的电泳迁移率，配以相关智能软件分析最终结果，从而实现了结果分析的智能化，减少了人为判断的误差。为了推动这一分型新策略在世界范围内的广泛应用，国际免疫遗传协会于2001年成立了包括本研究室在内的国际上7个著名HLA实验室参加的国际HLA一RSCA协作组。因此，本研究首先建立健全RSCA分型系统，并通过国际参比DNA标本对系统的稳定性、准确性、可复性及特异性进行标准化验证。在此基础上，在首次将 RSCA分型系统应用于临床移植标本的分型中，分别对84例和90例(共123例，其中51例两个位点均有)拟进行造血干细胞移植供一受体的HLA一A和B位点进行了 RSCA与PCR一SSP分型方法的比较分析，以进一步确定RSCA在基础研究及临床实践中的应用价值。本研究第一部分是建立并稳定HLA一A位点的RSCA分型系统。首先采用国际HLA一RSCA协作组提供的20例标准分型DNA以及2例PEL一FREEZ公司赠送的样品DNA进行HLA一A位点的RSCA分型，将分型结果递交国际HLA一RSCA 舅浑霍羹不径受竺琴全禾于写全l资乞子亘反」二三等全{立初全二多〔协作组进行认证比对，证明本研究所建立的HLA一A位点RSCA分型系统是稳定可靠的，重复率达100%。此外，本文还随机选用20例临床标本对RSCA的可复性进行了一再确定，每例标本用RSCA方法重复3次，重复率均为100%。随后，我们选取84例拟进行造血干细胞移植并来我室进行HLA分型供一受体的临床标本进行HLA一A位点的RsCA分型，这些标本均已进行了HLA一A、B、DR及DQ位点的PCR一SSP低分辨基因分型。结果显示，RSCA分型在81/84例标本中均能得到准确可靠的结果，并且有33/84例标本可直接得到等位基因水平的分型结果; 有2例标本因DNA浓度太低导致PCR扩增较弱，RSCA未能对其进行分析;另有l例标本用RSCA方法只能指定1条等位基因，，另1条无法指定，为此我们分别采用直接测序法和PCR一SSP高分辨技术对其进行鉴定分型，分型结果均为 HLA一A*2404，是一条己知等位基因但RSCA数据库中尚未列入的基因型别。而在PCR一SSP低分辨基因分型的84例标本
【图文】：

电泳图,分型,位点,特异性引物

在内参带与引物带之间的DNA扩增带即为阳孔，B图的阳性带为第2、14孔。置标记在HLA一I类位点PCR一SSP低分辨分型读本HLA一A位点的分型结果。这种方法比较快速、异性结果出现，并且在有的电泳结果中还常会出现子量1200bp)，这些都需要重复实验。84例临床标详见表2。点RSCA分型系统的稳定性、准确性及重复性鉴定型系统对标本HLA一A位点进行引物扩增后，扩增包括HLA一A位点的外显子2、内含子2、外显子果见图2。

电泳图,分型,电泳图,位点

图3.HLA一A位点的RSCA分型电泳图电泳共40个泳道，第1、14、27、40泳道是Ladde:电泳道，从下向上定义的值分别00，0，1136.8，1253.5，1362.7，1520.9，1729.4及3000.0，箭头所指为1000和3000的Marke它的电泳泳道也都有1000和3000的标准Marker，其中第2、3泳道为第1个样品，道是第1个样品与荧光标记参照链1杂交后电泳结果，第3泳道是第1个样品与荧光标照链2杂交后的电泳结果。依次向后排，共可电泳18个样品。图4显示HLA一A位点RSCA分型结果峰型图，杂交链电泳峰位于100000的Marker之间，标本若为杂合子，则在上下Marker之间有三个峰(第一为同源参照链杂交峰)，见图4A，若为纯合子，则只有两个峰，见图4B。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392

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