小鼠ES细胞的定向诱导分化与建系实验研究

发布时间：2020-05-10 17:53

【摘要】： 近年来，胚胎干细胞(ES cells)以其具有全能性、可操作性和可塑性等诸多优点，已经成为医学和生命科学领域研究的热点之一。研究者们试图用ES细胞建立糖尿病、老年型痴呆、帕金森氏症等遗传疾病转基因动物模型。在这些研究中，最关键的是ES细胞的来源和定向诱导分化问题。进行一系列研究必须要有足够的ES细胞，特别是建立转基因动物模型，需要10代以内的ES细胞；而用作细胞治疗研究也必须解决其他分化细胞的影响问题。 在我们的实验中，以小鼠ES—D3细胞系为对象，通过细胞培养大量增殖未分化细胞，再用两种方法进行ES细胞向神经细胞的诱导分化实验。首先从胚体(EBs)本身探讨ES细胞内部调控诱导分化的机制，用悬浮培养、悬滴培养、悬浮转悬滴培养的方法培养出不同时间的EBs，再加以RA处理，观察比较EBs对ES细胞神经分化的影响；在此基础上，用不同浓度的RA处理EBs，分析诱导剂RA对ES细胞神经分化的影响。结果表明，用10~(-6)M的RA处理悬滴培养3d转悬浮培养1d的EBs 4d，能得到较高的神经分化比例。 同时，为以后开展转基因动物模型的研究，我们还进行了小鼠ES细胞建系的部分工作。以ICR小鼠和昆明小鼠为实验对象，采用超数排卵的方法获得小鼠胚胎，培养在用丝裂霉素C处理过的ICR小鼠和昆明小鼠MEF细胞饲养层上，选取适当时间离散增殖的ICM和类ES细胞集落，分析了在小鼠ES细胞建系过程中，饲养层细胞、消化液及不同品系来源的胚胎的影响。从实验结果来看，ICR小鼠和昆明小鼠两种来源的饲养层细胞对胚胎贴壁、ICM增殖无影响，，消化液作用影响明显，以0.125％trypsin+0.02％EDTA消化10～15min为宜。以上结果表明：ICR小鼠比昆明小鼠更易进行ES细胞的建系工作。
【图文】：

的形态要好(图2)，ES细胞呈集落状或岛屿状生长，边缘清楚，结构致密，细胞之间界限部清楚。当撤去LIF及没有MEF细胞作饲养层的情况下，ES细胞就自发形成胚体(EBs)。用悬浮或悬滴不同培养方式得到的EBs(图3)分别用含1x10--‘mol/LRA的培养基培养4d，然后撤去RA，换用常规的ES培养基，24h后就开始分化(图4)，EBs外围逐渐出现成纤维细胞、扁平上皮细胞和神经元样细胞(当突起长度超过胞体直径的5倍时就判定为神经元样细胞[汤富酬，2001】)(图5)，同时有细胞凋亡现象。继续培养，神经元样细胞l旬形成网络样结构(图5)。图2ES细胞(a)长在MEF滋养层细胞上的ES细

Fig.4分化中的EBsDifferentiatingEBs
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R329.2

【参考文献】

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本文编号：2657670