成肌细胞与心肌细胞体外联合培养的实验研究

发布时间：2020-05-10 18:10

【摘要】： 心肌是终分化组织，不能再生，而且心脏内没有心肌干细胞，，因此心肌受到损伤后只能形成疤痕组织来修复，最后导致终末期心力衰竭，死亡。近年来，研究人员开始寻求以细胞移植的方法治疗心力衰竭、心肌缺血及扩张性心肌病等心脏病，缓解终末期心脏病的心室重构，减少死亡率，提高生活质量。用于细胞移植的种子细胞较多，有成肌细胞(即骨骼肌卫星细胞)，骨髓基质干细胞，胚胎、新生或成年的心肌细胞，胚胎或幼年组织的平滑肌细胞等，其中成肌细胞移植研究应用较多。成肌细胞移植后即在心肌的环境中，发生何种变化，是否能与心肌细胞形成闰盘似的电机械连接，即形成功能合胞体，既是研究热点又存在许多分歧，由于体内系统较复杂，常受到许多因素的影响，本实验建立体外成肌细胞与心肌细胞共同培养模型，模拟机体心脏内环境，研究心肌细胞与成肌细胞的相互影响和作用，另外本实验还详细介绍了分离、提纯和鉴定成肌细胞方法及其生长的生物学特性。方法：本实验采用原代培养的方法，以胶原酶Ⅰ和胰蛋白酶混合消化法获取成肌细胞，以非连续密度梯度离心法(Percoll分离液)分离、纯化成肌细胞；倒置光学显微镜下观察成肌细胞生物学特第四军医大学硕士学位论文性，绘制成肌细胞生长曲线;透射电镜下观察其超微结构;以一抗a一Actin，Desmin单克隆抗体及SABC免疫组织化学染色法鉴定成肌细胞;在自主跳动的成肌细胞中加入异丙肾上腺素 (Isoproteren。l，IP)使终浓度为20一7m口z咙一I，研究细胞对xP的反应性，分加药前和加药后两组，计数细胞自发跳动频率，进行统计学分析。建立成肌细胞与心肌细胞体外联合培养的模型:在体外分别分离、提纯成肌细胞和心肌细胞，以1:1细胞数混合(浓度均为 lxlos一，)接种于培养板中，观察其生长特性;在联合培养的第 5天收集联合培养的细胞，常规脱水、固定后在透射电镜(JEM一 2000EX)下观察是否存在桥粒和缝隙连接;取联合培养5天的活细胞爬片在倒置显微镜下进行细胞微注射研究，在以微电极刺入成肌细胞中，以自主扩散及方波电泳的方式使活化生物素 (Biocytin)分布扩散于成肌细胞中，固定后，以德克萨斯红标弓记的卵白素作为二抗标记，荧光显微镜下观察显色部位。结果: 胶原酶I和胰蛋白酶混合消化法能较好的分离成肌细胞，以 Percoll液非连续密度梯度离心法为分离、提纯细胞获得成肌细胞的纯度可达95%;成肌细胞多呈梭形或纺锤形，培养4至5天就可见有的细胞相互融合形成肌管;成肌细胞抗a一Actin和Desmin 染色相似，荧光为红色，多为椭圆形或圆形核的单核细胞，少数亦有双核;透射电镜下成肌细胞核仁有1一3个，胞浆中有不规则分布的肌丝，部分区域尚未形成，有成熟的线粒体、糖原、和游离的核糖体和溶酶体。原代培养成肌细胞融合后2一3天可以看到纤维的自发收缩，频率50一160次/分，加入IP后，细胞收缩频率增加约22.5%，统计学处理得p0.05，具有统计学意义，IP对成肌细胞有正性变时作用。联合培养的成肌细胞和心肌细胞，光镜下可见两者如心肌细第四军医大学硕士学位论文胞团样同步收缩;在透射电镜下很容易见到两者形成的桥粒连接，但较难见到间隙连接;微电极注入成肌细胞后，免疫组织化学染色可见:在与注入活化生物素的成肌细胞邻近的心肌细胞出现生物素的红色染色，说明生物素可以从成肌细胞通过两者之间形成的间隙连接进入心肌细胞，而使心肌细胞显色。结论: 1:胶原酶I和胰蛋白酶混合消化法能较好的消化获得成肌细胞，以Percon液密度梯度离心法是一种简便、有效分离提纯成肌细胞的方法; 2:介绍了成肌细胞的生物学特性，并详细描述了它的自发跳动特性，成肌细胞可能表达p受体; 3:成肌细胞与心肌细胞体外联合培养可形成有桥粒和缝隙连接组成的电机械连接，证实说明成肌细胞移植到心肌内，有与心肌细胞形成闰盘的可能; 4:成肌细胞是进行细胞移植是一种有前景的种子细胞，这种体外联合培养的方法是研究移植机制良好的方法。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R329.2

【参考文献】