重构型人Caspase-8基因的表达及其促凋亡活性

发布时间：2020-05-12 14:44

【摘要】： 细胞凋亡(apoptosis)是细胞在受到生理或病理刺激后发生的自发性的死亡过程。近年研究表明，半胱天冬酶(caspase)家族是细胞凋亡的关键执行者。根据caspase在细胞凋亡中的不同作用，可将其分为3个亚类：ICE(IL-1β converting enzyme)亚类、凋亡起始亚类(initiator)和凋亡效应亚类(effector)。其中凋亡起始亚类包括caspase-2、-8、-9和-10，凋亡效应亚类包括caspase-3、-6和-7。 Caspase-8属于起始caspase，在死亡受体介导的细胞凋亡中，caspase-8处于凋亡信号通路的上游，其活化遵循“诱导接近模式”(induced proximity model)，即三聚体化的死亡受体经FADD或TRADD募集caspase-8，形成“死亡诱导的信号复合体”(DISC)，使得caspase-8间相互催化并活化。 1997年，Muzio等证实，去除氨基端原结构域的caspase-8可以有效地激活 — — caspase习、J和习。1998年，S灿vasula等构建了大、小亚基次序颠倒的重构型人 caspase上和七，它们具有高效的促凋亡活性。由于c卿ase家族分子在结构上具有相 似性，我们推测，大、小亚基次序颠倒的重构型人caspaseE也应当可以自动折叠成 活性型的二聚体结构，并具有持续的促细胞凋亡活性。 在本研究中，我们用RT干CR的方法从人Jurkat细胞系中克隆了人caspase｛ 催化结构域基因。采用重组PCR，构建了两种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人 caspaseS基因仰和SLL卜随后，将重构的人caspase8基因克隆入真核表达载体 pllLESZEGFP中，瞬时转染HeLa细胞，研究与EGFP共表达的重构型人caspaseE 的促凋亡活性。另外，我们还研究了去除氨基端原结构域（N中rodomain）的caspaseE （即LS）的促凋亡活性。 我们用Western blot、间接免疫荧光等方法证实了重构型人caspaseS基因的表 达。借助荧光显微镜，我们观察到，与pIRESZ＊GFP空载体转染组比较，SL和SLL 实验组被转染细胞在转染后20小时即出现变圆、皱缩。惜助DAPI染色，可明显看 到染色质固缩等典型的细胞凋亡特征。该现象也被免疫细胞化学染色结果及电镜观 察结果所证实。细胞骨架染色结果显示，SL和SLL转染组阳性细胞没有完整的细胞 骨架，细胞极度皱缩。而同批同时转染空载体的HeLa细胞仍有大量的EGFP阳性 细胞贴壁生长，且形态完好；LS转染组仅见有少量的皱缩、固缩细胞。借助倒置显 微镜，我们看到，SL和SLL转染组培养液中可见大量的悬浮细胞，而空载体和LS 转染组细胞仍贴壁生长，状态良好，仅见有少量的悬浮细胞。 因此，我们认为，大、小亚基次序颠倒的重构型人caspase8门SL和SLL） 可以在细胞胞质中自动折叠成活性型的二聚体结构，，并具有自发的、持续的促细胞 凋亡活性，可以快速、高效的引发HeLa细胞凋亡，而去除氨基端原结构域的 caspase毛（即LS）即使过表达也不足以诱导HeLa细胞凋亡。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：Q78

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本文编号：2660376