分泌表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组BCG的构建、表达及免疫学特性的初步研究

发布时间：2020-05-12 11:45

【摘要】： 结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(MTB)引起的以呼吸道传播为主的慢性传染病。据WHO估计，目前全世界约有1/3人口感染MTB，每年有1000万新发患者和300万患者死亡。贫穷、人口增加、流动人口增多、耐药MTB增多及艾滋病流行等使TB问题雪上加霜。我国是全球22个TB高负担国家之一，现有MTB感染人数已达4亿，传染性TB患者达到200万。卡介苗(BCG)虽被广泛用于预防TB，但其效果仍不够满意。研究认为BCG可预防并减轻儿童的严重TB，但对成人肺TB的预防作用从0到80％不等。导致此现象的原因在于BCG菌株的变异使保护性抗原丢失、人群间遗传或营养的差异及环境等因素的影响。鉴于BCG自身的不足，以及当前TB流行的严重性，研究新的疫苗用于TB的预防已成为当前国内外研究热点。目前正在研究的TB疫苗包括亚单位疫苗、基因疫苗、减毒活疫苗和重组BCG(rBCG)等。rBCG是利用基因工程技术将外源基因导入BCG中，依靠BCG在宿主内的复制，表达特定的外源抗原，以诱导对某些疾病的特异性体液和细胞免疫。rBCG集佐剂和载体于一身、兼不同的外源基因与活疫苗于一体，一次接种可获得强而持久的多种特异性免疫。因此，利用分子生物学和基因工程的方法对BCG进行改造是新型TB疫苗研制第四军医大学硕士学位论文的一个重要方向。 M犯的保护性抗原存在于其短期培养物滤液(s T-CF)中。ST-CF主要是由MTB在生长过程中产生的分泌性分子及胞内释放出的某些分子组成，含有200多种多肤。其中ESAI’-6蛋白是MTB感染早期介导细胞免疫应答的主要优势抗原，可致MTB再感染小鼠的一记忆效应T细胞增殖及 IFN一Y早期大量产生，IFN一Y可显著活化巨噬细胞，提高巨噬细胞对胞内 MTB的生长抑制作用和杀伤能力。ESAI飞6蛋白仅存于致病的MTB中，而在各种BCG菌株中均缺失。本研究首先将ESAI’-6蛋白基因克隆到pDEZ:载体中，构建大肠杆菌- 分枝杆菌穿梭分泌表达质粒pDE22一ESAI’-6，电穿转化BCG，构建成分泌表达ESAI’-6蛋白的rBCG菌株。7H9液体培养基培养rBCG，收集培养上清，用SePhadexG一50凝胶层析粗分离ESAr-6蛋白，小分子蛋白的 Tricine一SDS一PAGE检测ES户a’-6，结果显示有6kDa大小的条带，表明所构建的:BCG可分泌表达ESAI’-6蛋白，且dot blotting进一步证实了目的蛋白的表达。分别接种rBCG和普通BCG于7H9培养液中，37℃振摇培养，测定不同时间点的0D600nm值，绘制生长曲线。结果表明，rBCG的生长特性与普通BCG无明显差别。用分泌表达ES户L1’-6蛋白的rBCG和普通BCG分别经背部皮下免疫 BALB/c小鼠(免疫剂量均为1护CFu)，，同时设生理盐水对照组，免疫6w 后，采用不同方法分别测定各组免疫小鼠的特异性体液免疫和细胞免疫水平。ELISA检测各组小鼠血清中特异性抗体的结果表明，:BCG和BCG免疫组的小鼠均产生了抗MTB H37Rv株培养滤液蛋白(CFP)的高滴度抗体，且rBCG免疫组小鼠血清抗体滴度(l:8000)显著高于BCG免疫组小鼠血清的抗体滴度(l:1400)(尸0.05)。分离各免疫组小鼠的脾淋巴细胞，体外用抗原刺激，MTT法检测淋巴细胞增殖反应和检测IFN斗的产生水平。结果表明，rBCG免疫组的IFN一Y含量达到1 993士1 05p留ml，明显高于BcG 免疫组的1463士107 pg/ml(尸0 .05)，而生理盐水对照组IFN一Y含量只有 230士56p留ml;rBCG免疫组的脾淋巴细胞增殖显著，其刺激指数为4.34，明显高于BCG免疫组的脾淋巴细胞增殖指数3.79(尸0.05)，而生理盐水对照组淋巴细胞的增殖不显著，刺激指数只有1.33。 4 第四军医大学硕士学位论文综上所述，分泌表达ESAI’-6蛋白的rBCG与普通BCG相比可刺激更强的体液免疫应答和细胞免疫应答，但其对MTB感染的保护性等还需进一步的研究。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

【参考文献】