逆转录病毒介导的人类多药耐药基因（MDR1）cDNA转染和表达的实验研究

发布时间：2020-05-19 16:10

【摘要】：基因转移是指用物理或生物学的手段，将外源性基因导入受体细胞并使之表达的一种技术。逆转录病毒作为载体，可高效稳定地向哺乳类细胞中转入外源性基因。我们应用磷酸钙沉淀法将含有人全长MDR1 cDNA的逆转录病毒载体pHaMDR1／A转到包装细胞PA317中，建立了产病毒细胞，其最高病毒滴度为3.35×10~3CFU／ml，命名为PA317-HaMDR1／A1。分别用上清感染法和共培养法将PA317—HaMDR1／A1产生的病毒颗粒感染NIH3T3和K562细胞，然后用秋水仙碱筛选出耐药的转染细胞株NIH3T3／MDR1和K562／MDR1，用于各顼实验。PCR分析基因组DNA，PA317—HaMDR1／A1，NIH3T3／MDR1和K562／MDR1均出现特异的157bp带。Southern杂交分析，PA317—HaMDR1／A，NIH3T3／MDR1和K562／MDR1基因组中均出现特异的3．4Kb带。表明了产病毒包装细胞PA317—HaMDR1／A已整合有外源性的MDR1 cDNA，，并且能产生具有双向性感染能力的病毒颗粒。它能感染NIH3T3和K562细胞，外源性MDR1 cDNA稳定地整合在被转染细胞的基因组DNA中。抗P—糖蛋白单抗免疫组化法显示，被转染细胞表面P—糖蛋白阳性程度增高，RT—PCR分析，NIH3T3／MDR1特异的157bp MDR1 cDNA带为阳性，而NIH3T3为阴性；K562／MDR1特异的157bp带扫描密度为K562的7.0倍(β2—微球蛋白的cDNA PCR产物为对照)。表明了整合在被转染细胞的外源性MDR1 cDNA不论是在mRNA还是在蛋白水平表达均增高。按人类MDR1 cDNA设计的引物在转染的鼠类细胞的mRNA RT—PCR中能扩增出特异的带，说明了MDR1 mRNA表达水平增高为外源性MDR1 cDNA表达的结果．用计算机对实验所用引物序列与鼠的MDR1 cDNA序列进行比较，有意义链引物与鼠mdr1 cDNA序列的同源率最高为45％，反意义链引物最高同源率为80％，从理论上也证明了MDR1 mRNA水平增高为外源性MDR1 cDNA表达结果。MTT法分析，K562／MDR1的耐药谱为，对阿霉素、柔红霉素、米托葸醌、足叶乙甙、高三尖酯碱和长春新碱交叉耐药，其耐药倍数分别为7.8、8.1、7.0、2.24、4.86和2.27倍，而对阿糖胞苷无耐药性。表明外源性MDR1 cDNA表达的P—gp具有正常功能，被转染细胞具有MDR表型。转染后的细胞形态和生长曲线无显著改变。 以上结果表明，我们建立了一株能产生含有MDR1 cDNA的逆转录病毒的双向性包装细胞，PA317—HaMDR／A1，其具有感染各种类型细胞的能力。用逆转录病毒介导的MDR1cDNA转染，能使被转染细胞稳定整合和表达外源性MDR1 cDNA，MDR1mRNA增高，P—gp表达增高，具有完全的MDR表型，而本身的生物学特性不发生明显政交．以上产病毒细胞PA317—HaMDR／A1，可用于临床转染骨髓造血干细胞，进行MDR1基因转移保护骨髓细胞的研究，也可转染各种细胞，进行MDR药物和致敏剂的筛选。
【图文】：

因组DN人的s叨hton印迹分析为基因组DNA用EocRI酶切，与MDRIODNAxHT33和K562均无3.DRI/A的包装细胞K4b带，而用磷酸钙沉淀法P^317一HaMDRI/^1和I/^1产生的病毒颗粒转染的NIHT33加DRI均有所期望的3.4Kb带.该带为MRDI相似的带。结果进一步证明，用携带MDRI中的基因组DNA整合有外源性的MDRIPA、K5cDNA用DcNA带的密度远低于PA317一H咖RDIA/1和MDRIDcNA拷贝高于前两者。DCN^。NPA317一(Kb

/入rDRI和K562/MoRI细胞MDRlmRN照物(PBR322/Hinfl)2.Mo伙1阴性对照562八xDRI4.K5625.NIH3T3/MoRI红霉素测定式细胞仪测定孵育120分钟时细胞内DNR含3细胞内ONR浓度为6CS.12士145.28，NJH31’DRI斗一环胞菌素A(e，·eosp。:s。，es人)为619·0浓度低于NxH31’3细胞内DNR浓度。NzH31一3(图7).提示转染后N1H3)·3细胞MDRI。DNA内DNR滞留减少，而且，P一gp的功能可被cs胞内DNR浓度却无明显差别〔图8)，可能与低本身有P一吕p表达(J’关。试验)/MDRI的耐药谱(Ml，T法)所示，K562/’&IDRI细胞对阿霉素、柔红霉素、米叉耐药，其耐药倍数为7.8、8.1、7.0、2.2弓、峨.86
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：1995
【分类号】：R346

【共引文献】

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本文编号：2671147