限制性显示PCR技术在丙型肝炎病毒基因芯片制备中的应用

发布时间：2020-05-21 12:20

【摘要】： 丙型肝炎病毒（HCV）基因型/亚型众多，HCV基因分型对丙型肝炎的临床治疗、HCV疫苗研制及鉴定传染源、追索传播途径等都很有意义。而现有的各种基因分型方法多有不足。利用新兴的DNA芯片技术能对生物样品作快速、平行、高通量检测的特点，我们尝试将其用于HCV的诊断和基因分型。探针的制备则采用创新性的限制性显示PCR（Restriction Display PCR，RD-PCR）技术，本研究探讨了该技术用于探针制备的可行性及效率。用限制性内切酶Sau3A I消化三个不同亚型的HCV全长cDNA，所得的限制性内切酶片段与通用接头相连，通过10个选择性引物进行分组（限制性）PCR，使各片段得以扩增并分布于10个亚组中，经琼脂糖凝胶电泳分离。切割出凝胶中的单一条带后作二次PCR甚至三次PCR，得到较纯净的HCV cDNA限制性片段。对这些片段用T载体做亚克隆，并测序鉴定。以T载体亚克隆质粒为模板，快速扩增大量基因片段，，纯化后即可用于芯片打印。由三个不同亚型的HCV全长cDNA共得到了62个 200bP～1000bP大小的基因片段，平均每个亚型约20个。 RD—PCR技术最初是为解决差显技术中难以解决的假阳性而设计的，并经实验证实能有效地降低差异分析时的假阳性。该技术能根据基因组（无论序列已知或未知）大小的不同设计相应的分组引物，对扩增片段进行有效分组。普通的琼脂糖凝胶电泳即可分离片段，并以常规PCR反应条件就能大量扩增这些片段，其快速简便性不言而喻。本实验结果表明：利用限制性显示PCR技术，能较快速得到大量大小相对均一、适于芯片上分子杂交的探针。RD—PCR技术是非常优越和实用的基因片段收集技术。
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：Q78

【参考文献】