晚期蛋白氧化产物诱导人单核细胞分泌肿瘤坏死因子及其机制研究

发布时间：2020-05-22 11:55

【摘要】：背景 活性氧(ROS)是体内产生的一些反应性较强的含氧物质的总称，正常情况下ROS的产生与清除处于动态平衡状态，当二者失衡时就会产生氧化应激。过多的ROS不仅可以引发脂质过氧化、糖化氧化，而且可以引起蛋白质氧化。由氧化损伤导致的蛋白质生化和结构改变可引起功能改变，特别是代谢、酶活性或免疫活性的进行性丧失。ROS介导的氧化损伤导致氨基酸残基如酪氨酸的氧化，双酪氨酸形成后引起蛋白质凝聚、交联和断裂。AOPP(advanced oxidative protein products)就是近年发现的一种蛋白氧化产物。1996年Witko-Sarsat等首次在尿毒症病人血浆中发现AOPP。其特征是在酸性条件下于340nm有特异吸收峰，含有大量羰基及双酪氨酸，，主要存在于分子量600KD和80KD的蛋白质中。蛋白电泳表明600KD产物为白蛋白聚合体，通过双酪氨酸交联而形成。已证实慢性肾衰(CRF)早期即有AOPP升高，随肾衰进展而进一步升高，透析阶段AOPP浓度更高，提示尿毒症早期即存在明显的氧化应激(OS)状态。 AOPP在体内是由激活的中性粒细胞在髓过氧化物酶(MPO)作用下催化产生HOCl氧化白蛋白所致。体外用HOCl氧化白蛋白可得到与CRF病人血浆中类似的AOPP。对CRF病人的研究发现，血浆AOPP水平与单核细胞活化指标新碟呤(neopterin)、肿瘤坏死因子a(TNF α)及其受体间呈正相关。体外研究发现AOPP可引起中性粒细胞和单核细胞的呼吸爆发，提示AOPP可能是一种致炎性尿毒素分子。已知AOPP含有大量活性羰基。羰基产物可引起一系列的生物学作用，如刺激细胞因子、黏附分子和生长因子的分泌等。AOPP是否也能引起单核细胞细胞因子的产生目前还没有确切的证据。 我们以AOPP修饰的牛血清白蛋白作为AOPP模型，研究了AOPP对单核细胞分泌肿瘤坏死因子的影响及其可能机制。 方法 我们以单核细胞株THP一1和正常人外周血单核细胞(PBMC)为效应 细胞，观察AOPP一BSA对单核细胞分泌TNFa的影响，并对其机制进行了 探讨。 一、无内毒素AOPP一BSA的体外制备:采用Witko--Sarsat等介绍的方 法。将BSA与次氯酸分别以1/70、1/140和1/280的摩尔比例混合，室温 反应30min，制备出三种不同修饰程度的AOPP一BSA。制备的AOPP一BSA在 PBS中透析，以除去游离的次氯酸。 AO即含量的测定:酸性条件下34Onm 的光吸收，以氯胺T为标准。 二、正常人外周血单核细胞(PBMC)的分离:采用密度梯度离心法。 将抗凝全血与6%葡聚糖按5:1混匀，37℃静置6Omin，把血浆层轻铺在 淋巴细胞分离液(相对密度1.077)上，室温下以5009/min离心20min， 取中间云雾层细胞，用D一Hank液清洗后，于5%C姚孵箱中培养2小时后用 D一Hank液清洗以除去未贴壁细胞，将贴壁细胞消化收集，经抗CD68抗体 染色鉴定，苔盼蓝拒染试验证实为活细胞，调整细胞浓度备用。 三、人单核细胞株THP一1的培养:复苏THP一细胞株，悬浮培养于含 10%(V/V)胎牛血清的RPMI 1640培养基中。 四、TNFa的测定:ELISA法检测培养上清和用不同抑制剂预处理后 培养上清的细胞因子TNFa。采用深圳晶美公司分装的进口双抗体夹心 ELISATNFO检测试剂盒。按说明操作。 五、细胞内ROS的测定:采用荧光探针DCFDA标记细胞，其在细胞 内转化为DCFH。用VICTOR1420多标记分析系统在激发光485士10nm、发 射光535士10nm下动态测定细胞经不同刺激后细胞内氧化DCFH产生的荧 光量的变化，反映细胞内活性氧的产生量。 结果 1.A0即一BSA可诱导单核细胞分泌TNFa。三种氧化修饰程度的 AOPP一BSA均可显著性刺激THP一1和PBMC产生TNFa，氧化修饰程度越 高则TNFa分泌的量越多，相同氧化修饰程度的AOPP一BSA以剂量依赖的 方式刺激TNFa分泌，6h时迅速上升至高水平，12h~24h进一步达到平 台水平。未经修饰的BSA诱导产生TNFa的量不明显。 2.AOPP一BSA可刺激单核细胞产生ROS。PBMC经AOPP一BSA刺激后可 产生大量ROS，ROS的产生量与BSA的修饰程度及AOPP一BSA的浓度有关， 修饰程度越高，浓度越大，ROS产生量越高。抗氧化剂PDTC和小分子谷 肤甘肤活氧化物酶模拟物Ebselen可不同程度地清除AOPP一BSA诱导产 生的ROS。NADPH氧化酶抑制剂DPI可显著性抑制ROS的产生。 3.ROS介导了AOPP一BSA诱导产生TNFa (1)清除细胞内ROS可抑制AOPP一BSA诱导的TNFa分泌。抗氧化剂 PDTC 抑制AOPP诱导的ROS释放后，THP一和PBMC分泌的TNFa均显著减少。 (2)抑制NADPH氧化酶可抑制AOPP一BSA诱导的TNFa分泌。特异性 NADPH氧化酶抑制剂Apocynin以剂量依赖方式抑制TNFa分泌。 4.AOPP一BSA诱导产生TNFa与P38磷酸化有关。P38磷酸化抑制剂 SB203580可剂量依赖性抑制TNFa分泌。 结论 AOPP一BSA能诱导单核细胞分泌细胞因子TNFQ，其机制可能是通过 激活NADPH氧化酶释放ROS，然后使P38磷酸化，进一步导致了细胞因 子TNFa分泌。
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R363

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本文编号：2675958