小鼠腹腔巨噬细胞内基态游离钙离子浓度的不均一性及其和细胞反应性的关系

发布时间：2020-05-22 21:03

【摘要】： 作为重要的炎细胞，巨噬细胞的反应性在炎症发生发展中起着重要作用。对于炎症过程中巨噬细胞反应性的变化文献上已有许多报告，但结果不尽相同。这些工作都是用“细胞群”作为研究对象的，而我们认为既然巨噬细胞中存在表型不同的亚群，那么它们的功能也应该是不均一的。用细胞群进行的工作有它自身的局限性，而在单细胞水平进行研究可能会得到更为有意义的信息。因此，本课题主要研究了单细胞水平上小鼠腹腔巨噬细胞（PM）的反应性。根据我们的研究目的及现有条件，我们首先选择了基态的细胞内游离钙离子浓度（[Ca~(2+)]i）作为研究指标，并对小鼠PM的测钙条件进行了优化，最终确定小鼠PM[Ca~(2+)]i测定的条件为：PM贴壁时间30—90min；负载荧光指示剂的条件为2μM Fura-2/AM、0.04％ pluronic F-127，室温孵育1h；而且每一只小鼠都取细胞用EGTA/AM 法单独测定一批Grynkiewicz常数。对7只正常小鼠共392个PM基态[Ca~(2+)]i的研究表明小鼠PM的基态[Ca~(2+)]i呈正态分布，但波动范围较大（从低于20nM到高于100nM），以[Ca~(2+)]i在40—60nM的细胞数量最多（约占50％）。用PMA、fMLP刺激后PM[Ca~(2+)]i升高，但细胞间[Ca~(2+)]i升高的幅度各不相同，受刺激后[Ca~(2+)]i升高的峰值硕士学位论文一中文蛔耍一和基态［Caz”］i之间呈正相关（PMA刺激组：r＝0．52，P＜0＊l，n＝58； eLP刺激组：rso．59，p＜0．of，n＝44。此两组实验均以不同的小鼠重复3次，其他两只小鼠的结果与上同。下面的表述方法同此人这些结果说明正常小鼠PM的反应性可能是不均一的，而基态＊勺i水平的不均一是PM反应性不均一的基础。细胞的反应性一般是指具体的效应，而钙离子只是第二信使，因此我们又选择了一个钙离子依赖性的、常规用于反映巨噬细胞的活化水平和杀伤功能的效应指标—一超氧阴离子闭J。我们建立了可在同一个巨噬细胞同时定量检测 O厂和＊勺i的方法，随后在4 只小鼠检测了PM的基态＊ah］i与其产生 O厂的反应之间的关系，结果表明两者也呈显著正相关（r＝0．42，p刃＊，n＝43，重复 4次人从而进一步说明了巨噬细胞基态＊d勺i水平不均一性的意义。为了研究 PM基态［Cd勺 i不均一性的病理意义，我们利用小鼠 30％体表面积深＊度烫伤的病理模型，并检测其基态＊“］i和产生 OZ二水平的变化，结果表明 6 ／q烫伤小鼠基态rCal勺＊，11＜）显著高于 6只假烫小鼠（＊土28nM，n二。395，p＜0＊5），而且烫伤与假烫小鼠 PM的基态＊aD］i和正常小鼠一样也是不均一的，两者同样呈正态分布，只是烫伤鼠 PM基态＊aD］i的分布明显右移。另外， eLP刺激烫伤小鼠 PM后［Ca及］i升高的峰值C27川2nM，n刁）显著高于假烫鼠（207士3l删，11－398，p＜0．05），而且［Caf“］i升高的峰值与基态＊”h之间也呈正相关（烫伤组：，0．85，p功阴，n＜5；假烫组：小丑坦扈巨曹匆胞内篡在寸宵泻甫子政友的不均一伎及其和匆胞皿应伎的共系－3－顶士学位论文一中文灼召一 FO．3 5，，p功．01，一65。此两组实验均重复6次人fML P刺激后烫伤小鼠PM产生O厂水平N刀47切刀3n’细胞，n－4）也明显高于假烫小鼠（0＊38士0＊6／10’细胞，p＜0＊l，11－4）。正常小鼠PM中基态Kd勺i高的细胞，P肌刺激后生成OZ二也明显增多：烫伤小鼠PM基态［Cd勺i升高、oLP刺激后生成OZ二也明显增多，同时免疫组化的结果表明PKC－Q的表达水平也明显增加。由此我们想到，烫伤后由于PKC增加，在体外不再给与刺激时可能也会有 OZ‘的生成（暂时不严格地称之为“自发性” OZ二生成人我们的实验结果证实了这个想法，即烫伤小鼠体外生成“自发性” O厂的细胞仁总细胞数的 35ti6o，。6）明显高于假烫组0t2O，n＝6， p刃刀1人我们对此现象的可能的病理学意义也作了讨论。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R364

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