牛肝辅酶Ⅱ-依赖性视黄醇脱氢酶的cDNA克隆及组织表达分析

发布时间：2020-05-23 02:16

【摘要】： 目的 维甲酸类对于体内的各种生理过程起着重要的作用，在体内的合成过程中需要许多酶的参与。其中辅酶Ⅱ-依赖性视黄醇脱氢／还原酶(NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase／reducrase，NRDR)是黄东阳等于1997年从兔肝中发现并纯化的一种新的催化视黄醇脱氢／还原的酶，参与维甲酸合成的第一步反应。NRDR活性远大于迄今所报道的胞液的乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，，ADH)和微粒体内的短链脱氢／还原酶(short-chain dehydrogenase／reductase，SDR)类。现人、小鼠、兔NRDR cDNA已被克隆并在GenBank登录(登录号分别为[AB045131][AB045132][AB045133])，但尚无相关的论文发表。本研究根据已知的人、小鼠、兔的NRDR基因保守序列，设计合成特异引物，应用cDNA末端快速扩增技术(rapidly amplify cDNA ends，RACE)法，成功地克隆了牛的NRDR基因并在GenBank登录(登录号为AF487454)，并对该基因序列进行了分析。为进一步研究NRDR酶蛋白的功能及维甲酸的合成奠定了基础。 方法和结果 1．总RNA的提取和cDNA文库的获得 用TriZOI试剂提取总RNA，获总RNA约为100Og，RNA纯度 采用紫外分光光度计测定OD值，OD260亿80值为二．84－2刀。逆 转录使用TaKaRa的 Reverse TranscriPtase XL（AMV）试剂盒，以 OligO dT为引物获得CDNA文库。 2．gi物合成及NRDR cDNA部分片段的扩增 采用Jellyfish软件，根据人J鼠及兔NRDR保守序列的一致 性，设计一对引物，PCR扩增得到部分CDNA序列，经测序得到 294hP的部分片段。 3．RACE法克隆 3．13”RACE法克隆 根据TaKaRa公司（大连广”RACE试剂盒中的说明进行操 作。以已获得的 294hp的部分 NRDR片段为模板，设计 F引物J 引物为3”RACE试剂盒中提供的 3”site AdaPer umer，PCR扩 增经测序得到1200hp片段。 3．2 5”RACE法克隆 根据TaKaRa公司（大连广”RACE试剂盒中的说明进行操 作。以已获得的294hP的部分NRDR片段为模板，设计5”磷酸 化RT引物进行逆转录，获取单链CDNA完成第一步反应；再降解 杂环 RNA；接着进行连接反应一形成单链环状 CDNA或串联体。 设计两对引物，最后进行巢式PCR反应，扩增结果得到400hp和 200hp的片段，经测序鉴定200hp为所需的片段。 4．牛肝的NRDR基因全长CDNA的确定及序列分析 将重组与PGEM－T载体的5”－Nested RACE产物200hp 和 3”RACE产物 1200hp进行双向测序，拼接一条 1266hp的全 长 cDNA序列。利用 NCBI提供的开放阅读框架kPen reading rme，ORF）进行开放阅读框架的判定，从第24到806碱基为完整 的阅读框，全长为783、碱基序列，编码260个氨基酸。确认编码区 的起始密码子位于24hP，终止密码子位于806hP；5”端的非翻译 ·2· 区为二一23 hP；3”端的非翻译区为807－1266hP；多聚腺昔酸 （oyA）信号 aaaaa是在 1232－1237hP。其 cDNA序列通过 BLAST服务器进行查询与人J鼠、兔、大鼠和猪的CDNA序列显 示出80％以上的一致性，证明此基因为牛的NRDR CDNA序列。 GenBank数据库查询结果证实为一个新基因（GenBank登录号为 AF487454）。 5。蛋白质的功能位点分析 牛肝 NmR基因编码 260个氨基酸，其等电点为 8．6，分子量 为27．3 kDa。其氨基酸序列与人＊鼠、兔、大鼠和猪的氨基酸序 列比较显示有 75％以上的一致性。用 PROSITE数据库分析牛肝 NRDR的功能位点，发现含有天冬氨酸N一端糖基化位点、蛋白激 酶Chrotein kinase C，PKC）磷酸化位点、酪蛋白激酶11（Casein hi－ nase 11，CKZ）磷酸化位点、短链脱氢／还原酶瞩DR）家族标记及在 C一末端有过氧化氢酶体的 C一末端靶向信号（perokisomal targe－ ting signal，PfSI）序列 SHL。 6．结构功能域确定 用SMART软件服务器分析牛的NRDR蛋白质结构功能域， 发现在13－256含有一个典型的adh－shorthha00106）结构 域。 7．蛋白质序列多重对齐分析 用＊）软件进行NRDR蛋白质序列的多重对齐。结果 发现，牛 NRDR的氨基酸含有 SDR家族两个保守的模序 （TAXXXGXG）与（YXXSK）。 8．牛NRDR基因组织表达图谱分析 Tizol试剂提取各组织总RNA，在编码区内设计一对引物进 行RT－PCR反应，结果显示该基因在肝、肾、心、肺、胃、肠组织有 表达。 ·3· 讨 论 NRDR是参与维甲酸合成的第一步反应的酶。推导的NRDR 氨基酸含有 SDR两个保守模序和 SDR家族结构域及 SDR家族标 记，牛的 NRDR属于 SDR家族的新成员。并在其氨基酸的 C一末 端含有PISI，推导此NRDR存在过氧化物酶体内。但当初NRDR 是黄东阳等从兔肝的胞液里纯化的，所以对于NRDR是否存在过 氧化物酶体内还有待于进一步证实。如NRDR确实存在过氧化 物酶体内，视黄醛就需从过氧化物酶体内进人胞液合成维甲酸，这 种运输对于维甲酸合成的传统通路还应是一个补充。这也是过氧 化物酶体内
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【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：Q785

【参考文献】

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1 邢桂春,张成岗,魏汉东,贺福初;采用RACE技术获得全长人新基因MAGE-D1[J];中国生物化学与分子生物学报;2001年02期

本文编号：2676979