乙型肝炎病毒核心蛋白突变体抑制病毒颗粒包装的实验研究

发布时间：2020-05-25 06:02

【摘要】： 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）持续性感染在我国是一个严重的健康 问题，探索有显著疗效的治疗措施是目前的研究热点。基因治疗是抗HBV持续性 感染一个颇有希望的途径。随着分子生物学的发展，对HBV生物学性状尤其是复 制、包装过程的了解逐步加深：HBV颗粒包装始于核心颗粒（core particle）的形 成，二个核心蛋白形成一个二聚体，120个二聚体聚合成一个核心颗粒。核心颗粒 与前基因组RNA、DNA聚合酶结合，被覆表面蛋白后，包装形成成熟的HBV颗 粒。在这一过程中，起关键作用的是C蛋白二聚体的形成。利用突变型HBV C蛋 白干扰野生型C蛋白形成二聚体的显性负调节（dominant negative，DN）突变体， 已证明在体外有明显抑制HBV颗粒包装的作用，有望成为in vivo基因治疗HBV 持续感染的理想方法。 基于对HBV分子生物学性状和抗HBV感染胞内免疫的相关研究成果，，本研究对 中国人adr_1亚型HBV体外DN突变体治疗进行了基础研究。为此，我们通过PCR从 pHBV-A_1质粒中扩增了全长的C基因及S基因，亚克隆至pGEM-T载体上后，选择合 适方向的两株质粒进行C基因与S基因融合。构建出C蛋白C末端与S蛋白N末端 的融合基因表达质粒pcDNA3.1~+-CS。该表达载体经脂质体介导同时转染两株细胞 HepG2及HepG2215。转染48-72h后加入G418筛选10天左右。挑选阳性克隆扩增 后，RT-PCR和免疫组化证实了突变核心蛋白的胞内表达。直接抽提HepG2215细胞 浆内HBV DNA，斑点杂交显示表达了突变C蛋白（融合蛋白）的HepG2215细胞浆 内HBV DNA量不同程度地低于阴性对照组（未转染质粒和转染pcDNA3.1~+空质粒）。 10％ HBV阳性血清（PCR证实HBV DNA的存在）感染HepG2后72h，抽提细胞浆内 HBV DNA。斑点杂交显示，与阴性对照组比较，表达了突变C蛋白的HepG2不同程 度地抑制了HBV的攻击。 以上工作表明，本研究所构建的pcDNA3.1~+-CS真核表达载体可以在HepG2及 HePG2215细胞内表达出突变型核心蛋白，进一步研究表明该突变蛋白具有抗HBV 颗粒包装的显性负调节功能，能不同程度地提高转染细胞的胞内免疫能力。本研究 在成功构建了中国人adr_1亚型HBV感染的突变型核心蛋白表达载体的同时，证实了 国外DN突变体抗病毒感染结论，为进一步DN突变体抗HBV感染研究奠定了基础。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R373.21

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本文编号：2679681