柯萨奇病毒B4单、双siRNA表达载体的构建及其抗病毒作用研究

发布时间：2020-06-02 05:07

【摘要】：本文选择柯萨奇病毒B4(CVB4)为研究对象,构建了具有U6启动子的CVB4的P1A、P2A、P2B、P3D基因的单siRNA表达载体,在培养细胞内通过细胞病变效应的观察、收获病毒的TCID50、蛋白表达量和mRNA表达水平的测定检测了单siRNA表达载体对CVB4的抑制作用,并检测了转染单siRNA表达载体后不同时间用CVB4感染细胞单siRNA表达载体对CVB4的抑制作用。在此基础上,选择可有效抑制CVB4复制的单siRNA表达载体,转移其表达siRNA的基因片段,构建以CVB4 P1A、P2A为靶基因的双siRNA表达载体pU6/d-siRNA /neo/GFP/C1A-2A,检测双siRNA表达载体在培养细胞中对CVB4的抑制作用并比较其与单siRNA表达载体抑制作用的不同。 通过尾静脉注射法将pU6/d-siRNA /neo/GFP/C1A-2A注射入小鼠体内24h后,腹腔注射CVB4病毒,同时设正常对照组和pU6/d-siRNA/neo/GFP/neg对照组。分别在病毒感染后3d、1w、3w、6w、8w处死小鼠,检测小鼠的体重、血糖及小鼠胰腺组织内CVB4抗原的表达量及小鼠胰腺的病变情况。 本实验结果表明,构建的CVB4的单、双siRNA表达载体在体外培养细胞中可以抑制CVB4的复制;转染后24h感染CVB4,单siRNA表达载体对CVB4的抑制作用最强。单、双siRNA表达载体都可以在体外培养细胞内持续存在并表达siRNA达15d以上,并且双siRNA表达载体对CVB4的抑制作用比相同靶序列的单siRNA强。在CVB4感染诱导的IDDM小鼠模型中,双siRNA表达载体,可以抑制CVB4的复制,减轻CVB4感染小鼠胰腺β-细胞的破坏,减轻CVB4诱导的IDDM症状或阻止其发生。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R373

【参考文献】

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本文编号：2692651