微柱阵列型拓扑结构增强HepG2细胞TRPV通道的功能响应性

发布时间：2017-03-26 23:07

  本文关键词：微柱阵列型拓扑结构增强HepG2细胞TRPV通道的功能响应性，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：制备了微柱名义直径为4μm或10μm,名义间距为4μm或7μm,名义高度为4μm的聚二甲基硅氧烷微柱阵列型拓扑结构基底,研究了Hep G2细胞与拓扑结构基底复合后细胞瞬时受体电位通道TRPV1、TRPV4在基因和蛋白水平的表达及其功能响应性。细胞TRPV1和TRPV4在基因水平表达的评价采用定量PCR技术进行;TRPV1和TRPV4在蛋白水平的表达以免疫印迹和免疫荧光染色确认;TRPV1和TRPV4功能响应性的研究系以TRPV1和TRPV4激动剂辣椒素和4α-佛波醇-12,13-二葵酸酯刺激细胞,采用钙离子染料钙绿-1结合激光共聚焦显微技术记录钙内流动态过程,以钙内流荧光响应幅度及阳性响应比率进行评价。实验结果表明,Hep G2细胞接种于4种拓扑结构基底较之于平面基底上出现明显的形态铺展和极化程度变化。四种拓扑结构基底上细胞TRPV1和TRPV4的m RNA表达量均显著高于平面基底上相应值。且相同微柱间距(4μm、7μm),较大微柱直径(10μm)的基底促进细胞铺展,同时伴随着较高的TRPV1或TRPV4基因表达水平;相同微柱直径(4μm或10μm),较小微柱间距(4μm)的基底一定程度促进细胞铺展,但却伴随着较低的TRPV1或TRPV4基因表达水平。免疫印迹实验证实了TRPV1和TRPV4在蛋白水平的表达,且拓扑结构基底上TRPV1和TRPV4免疫荧光染色强度较之平面基底相应值明显增高或趋于增高。在激动剂作用下,TRPV1介导的钙内流表现为快速去敏感化(25秒内)的瞬态内流,且拓扑结构基底上阳性响应细胞比例或相对荧光响应幅度较之平面基底相应值增高;而拓扑结构基底上细胞TRPV4阳性响应细胞比例和相对荧光响应幅度较之平面基底均全面明显升高。上述结果表明,TRPV介导的离子信号可能是基底拓扑结构优化Hep G2细胞功能表型的重要信号机制。
【关键词】：HepG2细胞 PDMS微柱阵列拓扑结构 激光共聚焦显微技术 TRPV1通道 TRPV4通道
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要3-4
• 英文摘要4-9
• 1 绪论9-18
• 1.1 问题的提出和研究意义9-10
• 1.1.1 问题的提出9-10
• 1.1.2 研究意义10
• 1.2 国内外研究进展简介10-16
• 1.2.1 拓扑结构基底对细胞影响的研究概况10-12
• 1.2.2 肝细胞钙离子通道研究概况12-14
• 1.2.3 TRPV钙离子通道研究概况14-16
• 1.3 研究目的和研究内容16
• 1.3.1 研究目的16
• 1.3.2 研究内容16
• 1.4 技术路线16-17
• 1.5 创新点17-18
• 2 PDMS微柱阵列结构的加工及其与HepG2 细胞的复合18-23
• 2.1 实验仪器、试剂和材料18
• 2.1.1 实验仪器18
• 2.1.2 试剂和材料18
• 2.2 实验方法和步骤18-20
• 2.2.1 PDMS微柱阵列型拓扑结构基底的设计和制备18-20
• 2.2.2 HepG2 人肝肿瘤细胞株的培养20
• 2.2.3 HepG2 细胞与PDMS微柱阵列结构及平面基底的复合培养20
• 2.2.4 扫描电子显微镜制样及观察20
• 2.3 实验结果20-22
• 2.3.1 HepG2 细胞与PDMS拓扑结构和平面基底的复合20-22
• 2.4 讨论和分析22
• 2.5 本章小结22-23
• 3 PDMS平面基底和微柱阵列型拓扑结构基底上HepG2 细胞TRPV通道蛋白相关mRNA的表达23-31
• 3.1 实验仪器和试剂材料23-24
• 3.1.1 实验仪器23
• 3.1.2 试剂和材料23-24
• 3.2 实验方法和步骤24-27
• 3.2.1 样本中HepG2 细胞总RNA提取24
• 3.2.2 总RNA反转录成cDNA24-25
• 3.2.3 实时荧光定量PCR反应25-26
• 3.2.4 2%琼脂糖凝胶电泳检测26-27
• 3.2.5 统计学处理27
• 3.3 实验结果27-29
• 3.3.1 HepG2 细胞中TRPV通道蛋白相关mRNA表达的确认27-28
• 3.3.2 拓扑结构基底对HepG2 细胞TRPV1 和TRPV4mRNA表达的影响28-29
• 3.4 讨论与分析29
• 3.5 本章小结29-31
• 4 PDMS平面基底和微柱阵列型拓扑结构基底上HepG2 细胞TRPV1、TRPV4 通道蛋白的表达31-39
• 4.1 实验仪器和材料试剂31-33
• 4.1.1 实验仪器31
• 4.1.2 试剂和材料31-33
• 4.2 实验方法和步骤33-34
• 4.2.1 样本中HepG2 细胞总蛋白提取33
• 4.2.2 免疫印迹实验33-34
• 4.2.3 免疫荧光染色实验34
• 4.2.4 统计学处理34
• 4.3 实验结果34-37
• 4.3.1 拓扑结构基底和平面基底上HepG2 细胞TRPV1 和TRPV4 蛋白表达的确认34-35
• 4.3.2 拓扑结构基底对HepG2 细胞TRPV1 和TRPV4 蛋白表达的影响35-37
• 4.4 讨论与分析37
• 4.5 本章小结37-39
• 5 PDMS平面基底和微柱阵列型拓扑结构基底上HepG2 细胞TRPV1、TRPV4 通道的功能响应性39-46
• 5.1 实验仪器和材料试剂39-40
• 5.1.1 实验器材39
• 5.1.2 试剂和材料39-40
• 5.2 实验方法和步骤40
• 5.2.1 TRPV1 和TRPV4 功能响应的评价40
• 5.2.2 统计学处理40
• 5.3 实验结果40-43
• 5.3.1 拓扑结构基底对HepG2 细胞TRPV1、TRPV4 通道功能响应性的影响40-43
• 5.4 讨论与分析43-44
• 5.5 本章小结44-46
• 6 主要结论及后续工作展望46-48
• 6.1 主要结论46-47
• 6.2 后续工作展望47-48
• 致谢48-49
• 参考文献49-56
• 附录56
• A. 作者在攻读硕士期间科研成果56
• B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目情况56

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