人巨细胞病毒pp65单克隆抗体的制备及其体外中和活性鉴定

发布时间：2020-06-05 03:39

【摘要】： 目的 制备具有中和人巨细胞病毒(HCMV)感染作用的单克隆抗体并对其进行生 物学活性鉴定。探讨单克隆抗体在临床上的诊断和治疗作用。方法 用HCMV AD169株抗原免疫Balb／c小鼠5-6次后，取致敏的脾细胞和HGPRT SP2／0小鼠骨 髓瘤细胞进行融合，在HAT选择培养基中培养二周，间接ELISA法筛选阳性克隆， 挑取分泌抗体的杂交瘤株：再用间接ELISA进行鉴定，最终获得抗HCMV的阳性 杂交瘤细胞4株，用琼脂糖免疫双扩散法鉴定McAbs的亚类。取腹水经盐析法初 次提纯HCMV McAbs。Lowry法测定蛋白质浓度。在第6代HF细胞株上进行微 量中和试验；同时用辣根过氧化物酶(HRP)标记D7株McAb。结果 获得了4 株杂交瘤细胞株，制备的McAbs经间接ELISA和琼脂双扩散试验证实均能和 HCMV抗原结合，显示高度特异性。McAbs经盐析后D7株蛋白质浓度为 11． 2mg／ml，B5株蛋白质浓度13． 8mg／ml。其中D7株杂交瘤分泌的McAb经间接 ELISA和Western-blotting试验证明能和HCMV pp65抗原特异性结合。微量中和 实验亦证实该McAb具有中和抗体的性质。经HRP标记的该McAb(中和效价≥1： 128) 还能与细胞培养中的AD169株HCMV发生特异性核内及胞浆内染色反应， 且比间接免疫酶染法更快速、敏感、简便。结论 通过杂交瘤技术制备的抗HCMV pp65 McAb能和HCMV特异性结合并能在体外中和HCMV致细胞病变效应，为 临床快速、准确诊断HCMV活动性感染提供了有力试剂；抗为McAb作为HCMV 治疗药物的研发奠定了基础。
【图文】：

1长玉IV在HF组鲍1的CPE(xl仍)

瘤细胞折光性差，细胞壁皱缩。但可见少量形态良好、透亮的细胞。融合后第4一8天:SPZ/O细胞几乎全部消失，可见呈葡萄串状分布的融合细胞小集落克隆，透亮，折光性强。如图4。融合后第8一9天:细胞克隆迅速增大，，待克隆生长至培养孔1/3一1/2面积时，即可对所有克隆生长孔的培养上清进行检测。如图5。(图4)杂交瘤细胞克隆(4一8天)F194:Hybridomaelone(4一sd)(图5)杂交瘤细胞克隆(8一天)F195:Hybridomaelone(8一gd)3.4计算杂交瘤细胞融合率根据间接ELISA法测定克隆培养上清结果，计算融合率。本次实验融合后在96孔板出现的杂交瘤数目为60孔，融合率为62.5%
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R392

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本文编号：2697445