日本血吸虫8kDa钙结合蛋白基因的克

发布时间：2020-06-04 23:20

【摘要】： 血吸虫病流行于76个国家和地区，目前估计有6亿人口受威胁，感染人口约2亿。血吸虫感染者中约有1.2亿出现症状，其中2千万人有疾病的严重后果，每年估计至少有2万人死于血吸虫病。截至2001年底，中国尚有12个省的418个血吸虫病流行县，流行区总人口约99万。尽管使用了化疗及杀灭钉螺的方法，血吸虫病的控制仍然受到以下因素的阻碍：治疗方法(包括药物毒性、行政管理、血吸虫抗药性等)的限制；频繁的重复感染；疫苗研制的前景不容乐观；缺少对血吸虫许多生物学知识的了解。因而在这个血吸虫病防治研究的瓶颈期，大规模地从基因水平了解血吸虫基本的生物学、生理学，为新的治疗药物的研制及疫苗的研究提供基础知识和参考数据，具有重大的意义。在前期的研究中我们在国内外首次构建了日本血吸虫尾蚴cDNA文库，并用EST策略从文库中筛选到一个包含完整开放读码框的cDNA序列，与曼氏血吸虫8kDa钙结合蛋白(Calcium-binding protein,CBP)基因序列同源性达82％，所编码的蛋白具有2个EF-手的典型的钙结合蛋白保守结构域。本研究以所筛到的噬菌粒为模板，利用合成的引物进行PCR扩增，PCR产物(Sj8CaBP基因)片段长度为236bp。回收纯化后连接入pMD18-T载体并亚克隆入原核表达质粒pET32a(+)。重组表达质粒转化入BL21细胞，构建表达工种菌，并用IPTG诱导工种菌的表达。超声裂菌，离心后收取上清中的可溶性蛋白。SDS-PAGE分析表达上清液中的蛋白。同时做参照的菌株有BL21空白对照菌及pET32a(+)转化的BL21菌。结果可见特异性的表达条带，pET32a(+)质粒上的担体蛋白、Sj8CaBP融合蛋白的分子量分别约为21kDa和29kDa。重组蛋白用Ni-NTA树脂纯化后用SDS-PAGE进行分析，Sj8CaBP融合蛋白的纯度可达90％以上。 Western-blot的结果显示，Sj8CaBP融合蛋白可与小鼠抗6-His抗体反应，显示单一的反应带，但它与日本血吸虫感染兔血清及紫外照射致弱尾蚴感染兔血清都没有特异性的反应带出现。 EUSA检测的结果显示，SEA检测的效果证明所用的阴性及阳性血清具备检测性能。纯化后的sj SCaBP融合蛋白与感染兔血清没有免疫反应性。这个结果与Weste。一blot的结果是一致的。这可能是由于sj8CaBP基因是日本血吸虫尾黝的期特异性基因，在尾坳侵入宿主体内24h后就不表达，而且该蛋白的半衰期很短，导致该蛋白在宿主体内存在的时间很短，，激起宿主的免疫反应性检测不到. 本研究在己发现的新基因基础上，对该基因进行克隆、表达及蛋白的纯化，并对重组表达蛋白的免疫反应性进行了评价。从结果来看，该蛋白不可能发展为一种诊断抗原，但在疫苗的潜力上，我们的实验结果还不能说明该蛋白不具有发展为疫苗的可能性。我们已得到日本血吸虫新基因 skDa钙结合蛋白的重组表达蛋白，为下一步上动物实验，对其免疫保护性进行研究做好了准备。
【学位授予单位】：中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392

【参考文献】