以Adeasy系统构建重组腺病毒的方法学改进

发布时间：2020-06-07 08:40

【摘要】：目的 腺病毒AdEasy系统是一种利用原核细胞完成重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒之间的同源重组，快速构建重组腺病毒的好方法。我们将其中的某些步骤进行了改进，以获得一种更加高效、简便、快速构建重组腺病毒的方法。 方法 我们将腺病毒骨架载体pAdEasy-1通过电穿孔法转化E．coli BJ5183感受态细胞，经抗性筛选、酶切鉴定获得含pAdEasy-1的E．coli BJ5183／p菌种，并鉴定其稳定性。随后用CaCl_2法制备E．coli BJ5183／p感受态细胞。并转化含GFP的腺病毒穿梭质粒，利用E．coli BJ5183细胞内同源重组机制获得重组腺病毒质粒，经酶切鉴定并确定重组的位置。与常规的共转化方法相比较，了解这种方法的重组效率。将鉴定正确的重组腺病毒质粒进一步转化E．coli DH10B感受态细胞，获得高拷贝的重组质粒。以Pac Ⅰ酶切，，获得重组腺病毒DNA分子，脂质体法转染293细胞，产生基因组结构均一的重组腺病毒。感染原代血吸虫细胞进行腺病毒嗜性的初步研究。 结果 利用改进的方法，获得了具有高度稳定性可重复使用的E．coli BJ5183／p菌种，经CaCl_2法制备为感受态细胞后，可方便地用于转化重组穿梭质粒，并获得重组腺病毒质粒。与常规方法相比较，该法的重组效率有一定的提高。重组腺病毒质粒DNA分子转染293细胞，可观察到293细胞出现肿胀，圆缩等典型的细胞病 安徽医科大学硕士学位论文 变(C PE)，荧光显微镜观察细胞内有大量绿色荧光。进一步感染原代血吸虫细胞， 表明腺病毒对其有一定的嗜性。 结论改进后的方法构建重组腺病毒更加简便，重组效率较原方法提高，可在国内 普通的分子生物学和病毒学实验室内完成构建工作。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

【共引文献】

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本文编号：2701156