【摘要】：内皮细胞的迁移是血管生成的重要启动过程。多种血管生长因子如：内皮细胞生长因子(VEGF)，肝细胞生长因子(HGF)等通过复杂的信号途径诱导细胞的迁移。细胞内鞘氨醇激酶(SPK)是催化鞘氨醇生成1-磷酸鞘氨醇(S1P)的限速酶。S1P是具有很强促血管生成活性的脂类分子，通过细胞内和细胞外两种机制参与细胞迁移的调节。细胞内S1P可以作为第二信使参与血管生成信号的转导。分泌到细胞外S1P与细胞膜表面的特异G蛋白偶联受体-内皮细胞分化基因(EDG)结合，调节或激活多种细胞迁移信号。因此，SPK是细胞迁移活动中的重要信号分子。 多种细胞因子通过不同的信号途径激活细胞内的SPK。HGF，又称扩散因子(SF)具有非常强的诱导细胞迁移的作用。我们的研究证明HGF和受体c-Met相互作用可以激活内皮细胞的SPK，但是，SPK在HGF诱导的细胞迁移中的作用并不清楚。为此，我们构建并制备了携带人SPK野生型和突变体基因的重组腺病毒载体，利用腺病毒载体介导的基因转移方法将SPK野生型基因或其突变体导入内皮细胞，评价了SPK在HGF诱导内皮细胞迁移中的作用。我们利用Bgl Ⅱ、NotⅠ限制性内切酶位点将全长SPK基因(SpK~(WT))及突变体SPK基因(SPK~(G82D))克隆至Ad-Easy腺病毒系统的穿梭载体Pshuttle-cmv，获得Pshuttle-cmv-SPK~(WT)及Pshuttle-cmv-SPK~(G82D)；利用内切酶将其线性化后，转化BJ-AD-1感受态细胞，获得Re-ad-SPK~(WT)及Re-ad-SPK~(G82D)腺病毒重组质粒。经测序和酶切鉴定正确后，利用脂质体介导的基因转移方法，，将Re-ad-SPK~(WT)及Re-ad-SPK~(G82D)转染293细胞，获得重组腺病毒rAd-SPK~(WT)及rAd-SPK~(G82D)；在293细胞中分别扩增rAd-SPK~(WT)及rAd-SPK~(G82D)纯化病毒；以噬斑分析法测定病毒感染梯度。获得了携带SPK基因的重组腺病毒。 内皮细胞ECV304表达HGF的受体c-Met。同时表达S1P的受体EDG，因此是研究HGF与SPK关系的理想模型。我们利用细胞扩散盒技术确定了HGF诱导ECV304细胞迁移的作用。另外，HGF和c-Met结合可以激活细胞内SPK的活性。我们分别利用携带SPK野生型基因和突变体基因的重组腺病毒感染ECV304细胞。发现细胞内野生型SPK基因过表达可明显增强HGF诱导的内皮细胞迁移；而表达SPK突变体基因阻断内源性SPK酶的活性则可以抑制HGF诱导的ECV304细胞的迁移。研究结果表明，SPK参与调控HGF／c-Met诱导的内皮细胞迁移的信号转导。SPK有可能作为新的靶点用于血管生成的治疗。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346
【共引文献】
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2703375
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