大鼠蛋白聚糖Ⅱ重组腺病毒载体的构建及初步鉴定

发布时间：2020-06-14 15:34

【摘要】： 研究背景和目的糖尿病肾病(DN)是导致终末期肾病的主导因素，也是糖尿病患者致死、致残的主要原因。在高血糖条件下，肾小球系膜细胞对细胞外基质(ECM)成分合成和分解代谢的紊乱直接导致了糖尿病肾病的发生和发展。同时，越来越多的证据表明系膜自分泌的转化生长因子-β(TGF-β)的活性介导了高血糖对肾脏的作用，而且TGF-β是人类和实验性糖尿病肾小球硬化发展的主要决定因素。在高糖条件下下调TGF-β信号的治疗途径为我们提供了一个抑制DN发生、发展的策略。蛋白聚糖Ⅱ，又称decorin(DCN)是一个37KD，分泌性蛋白聚糖，含有一个富亮氨酸重复序列的核心蛋白和一条糖胺聚糖链。DCN的作用包括了基本生物学功能的调节，比如基质组装，纤粘蛋白和血小板反应素介导的细胞粘附的调节。而DCN另一个更重要的作用就是调节促细胞增殖及组织纤维化过程中的关键因子—TGF-β的活性。有证据说明DCN通过其核心蛋白与TGF-β1结合可以直接中和其活性。为更好地揭示在高血糖环境下，DCN对TGF-β活性、细胞增殖及组织纤维化的抑制作用，并探讨利用DCN基因转染防治DN的可能性，本实验将通过从大鼠浙江大学硕士学位论文肾组织中直接扩增出DCN基因序列并构建大鼠DCN重组腺病毒载体，为研究高血糖时DCN对TGF一p的调节作用及DCN对糖尿病肾病治疗的可能性奠定基础。实验设计和方法成年雄性SD大鼠1只，体重2009，麻醉后迅速取出左侧肾脏，去包膜。从肾皮质中用经典方法提取总RNA，逆转录成为cDNA后，用高保真聚合酶扩增出DCN序列。将DCN的PeR产物和AdEasy系统中的穿梭载体pshuttle一CMV(pSC)质粒用Bgln和Hindin双酶切后利用T4 DNA连接酶进行连接。将连接产物转化至DH5a感受态细菌中，涂板(卡那霉素抗性)，37℃孵育过夜。挑取克隆，扩尹增，抽提质粒并经PCR、酶切及测序鉴定。将正确质粒用Pmel酶切线性化，然后用电转化的方法将穿梭载体转入BJS 1 83~AD一1感受态细菌(包含腺病毒骨架质粒pAdEasy一l)中，涂板(卡那霉素抗性)，37℃孵育过夜。挑取克隆，扩增，抽提质粒称为AD一DCN质粒并经PCR、酶切鉴定。同时构建对照腺病毒载体质粒AD一LacZ，只需电转化步骤。扩增经鉴定正确的腺病毒载体质粒，用Pacl酶切纯化后，应用MBS转染试剂盒将质粒转入50%一70%融合的AD293细胞中。当出现细胞病变效应时，收获细胞及培养上清，一70℃一37℃反复冻融3次，剧烈振荡后离心收集上清，一70 ℃备用。用原代病毒上清继续感染AD293细胞，以形成第二代病毒。实验结果 1.获得SD大鼠肾组织的DCN片段从成年SD大鼠肾脏皮质中抽提出总RNA，RNA电泳显示3个条带，证明 RNA抽提完整。将RNA逆转录成cDNA后用高保真的聚合酶扩增出DCN序列， 1%琼脂糖凝胶电泳显示片段在1100饰左右。 2.构建成功AD一DCN质粒与AD一LacZ对照质粒及两者的鉴定结果双酶切后的DCN片度和PSC进行连接，获得PSC一DCN，载体引物PCR、双酶切后电泳显示有1100左右的片段条带。测序结果表明从ATG顺数除第117 浙江大学硕士学位论文位碱基出现突变，由原来的c突变为t外，其他碱基不变。但此突变没有改变翻译后的蛋白序列。PSC一DCN、PSC一LacZ电转化入BJS 183.AD一1细菌中后获得 AD一DCN和AD一Lacz质粒。PcR、酶切后电泳鉴定有1 100bp左右的片段条带。 3.重组腺病毒质粒在AD293细胞中包装及第二代病毒感染结果腺病毒质粒DNA，用MBS转染试剂盒将其转入AD293细胞中，至细胞培养第13天，90%的AD293细胞出现细胞病变效应并收集细胞及培养上清。一70 ℃~37℃反复冻融、振荡、离心后取上清感染AD一293细胞。至第5天几乎所有细胞均出现细胞病变效应，证明包装病毒为有活性的腺病毒。结论 1.成功地从大鼠肾皮质中扩增出DCN基因序列并鉴定正确。 2.构建了大鼠DCN的重组腺病毒载体质粒，经PCR、酶切鉴定为正确克隆。 3.在AD293细胞中成功包装出活性DCN腺病毒载体，为研究DCN的生物学特性并为糖尿病肾病的基因治疗奠定了基础。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

【参考文献】