猪内源性反转录病毒gag基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

发布时间：2020-06-15 23:05

【摘要】： 根据已发表的PERV gag基因核苷酸序列，设计并合成用于扩增PERV gag基因的引物，并在引物5′端分别引入Sal Ⅰ、Not Ⅰ酶切位点。从中国实验小型猪外周血淋巴细胞RNA中扩增gag基因。将PCR产物与pGEM-T载体连接，常规方法转化E.coli JM109感受态细胞，挑白色菌落，经过夜培养后小量提取质粒，NotⅠ、SalⅠ双酶切鉴定、筛选阳性克隆重组子。对阳性克隆，用ABI377自动序列分析仪进行全序列测定，用DNASIS和NCBI的BLAST2.0程序进行同源性比较。序列分析结果表明，所克隆的gag基因全长1 572bp，编码524个氨基酸；与其它来源的同源序列相比较，仅有三个核苷酸存在变异。分别是位于N端第1054位的C→T，位于N端第1180位的A→G，及位于N端第1560位的A→C的变异。 为进一步探讨PERV gag蛋白的特性与功能。提取PERV gag重组质粒pGEM-gag，Not Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切重组质粒，凝胶纯化后，插入经同样酶切处理的pGEX-4T-3融合表达载体中，转化DH5α感受态细胞，菌落PCR和NotⅠ、SalⅠ双酶切鉴定阳性克隆。对阳性克隆，用ABI377自动序列分析仪进行全序列测定，测定显示其具有正确的读码框。将该表达载体转化BL21感受态菌株，并对表达的融合蛋白进行鉴定。SDS-PAGE和Western Blot结果显示：pGEX-gag在大肠杆菌中获得高效表达，融合蛋白分子量为86KDa，与理论推算值相符，测得该蛋白表达量约为18％。从诱导3h的菌液中提取包涵体，上清与沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，结果发现沉淀中于86KDa处有一很浓的蛋白带，而上清中几乎没有，表明pGEX-gag在大肠杆菌中的表达产物主要以不溶性的包涵体形式存在。对其进行变性、复性处理后，利用离子交换层析柱对表达的目的蛋白进行了初步纯化。将融合蛋白免疫大耳白兔，用ELISA法检测到抗PERV抗体， 1 中文摘要 效价为 1：32 000，用表达的gag融合蛋白作为包被抗原初步建立了间接ELISA 法。结果，表达的GST—gag蛋白具有良好的抗原性和特异性，为从分子水平上 对 PERV gag蛋白的功能性研究和发展 PERV基因工程监测试剂奠定了基础。 具有特异抗原性的GST融合蛋白的成功表达为猪内源性反转录病毒监测试 剂盒的研制奠定了基础，对保障猪源生物制品的安全具有意义。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R346

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本文编号：2715133