MLO-Y4中Cbfal诱导表达新基因的分离

发布时间：2020-06-16 03:33

【摘要】：骨骼的形成和发育是与许多因素相关的复杂过程，转录因子是影响骨生长非常重要的因素。目前已知与成骨细胞分化相关的转录因子有两个：Cbfa1(Core Binding Factor 1)和Osx(Osterix)。Cbfa1于1997年被证明是控制骨形成的关键因子，适量表达可以促进成骨细胞的早期分化；而过量表达会抑制成骨细胞的成熟。2002年Kazuhisa等用抑制性消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)的方法分离出转录因子Osx。Cbfa1和Osx基因分别作用于成骨细胞分化的不同时期：Cbfa1调控间充质细胞向前成骨细胞分化，Osx在前成骨细胞向成骨细胞分化过程中起作用。 本论文直接目的是分离可被Cbfa1诱导的新基因，长远目标在于找到与骨骼细胞分化相关转录因子。本文以具有早期骨细胞特征MLO-Y4(Murine Long Bone Osteocyte-Y4)细胞为研究对象，将Cbfa1基因转染到细胞内后，用抑制性消减杂交(SSH)方法进行新基因分离，成功构建了Cbfa1诱导下表达基因片段文库。从文库中随机选出的83个阳性克隆中，含有Cbfa1基因片段克隆24个，含有其它已知基因片段克隆19个，含有未知基因片段克隆40个，占克隆总数的67.8％。实验用Virtual Northern blot方法证明了其中一个没有同源序列的未知基因是Cbfa1诱导下表达的新基因。因为，在Cbfa1诱导的已知基因中有Osx存在，所以， MLO一Y4中Cbfal诱导表达新基因的分离 实验进一步以RT一PCR法证实在MLO一Y4细胞中Cbfal可以诱导osx表达。 本实验同时用RT一PCR法在另两种成骨细胞MC3T3一El、UZOS中也检测 到了Cbfal诱导osx的表达。
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346
【图文】：

在这些细胞中缺少Cbfal以外其他与Osx表达相关的转录因子。由于Cbfal和osx在成骨细胞分化过程中的作用时期不同，所以敲除它们的小鼠在表型上也存在一定差异。cbfal一/--小鼠的肪骨和股骨中没有肥大软骨细胞标记基因的表达〔28]，在可能出现肥大化软骨细胞周围的细胞外基质中也只有很低程度的钙化〔291。在osx一/一小鼠中，肥大软骨细胞标记基因表达均正常，在肥大软骨细胞出现中心基质中钙化程度也比较大。出现这些差异的推测原因是，肥大软骨细胞标记基因的启动子序列中有只存在Cbfal结合位点〔30.3，·’〕。osx缺失同样完全抑制成骨细胞分化，但是破骨细胞分化，血管侵入，软骨细胞分化和软骨形成均正常【5]。Kazuhisa等推测Cbfal和Osx在成骨细胞分化中的作用关系如图1。Cbfal在间充质细胞分化成前成骨细胞过程中起作用，osx在前成骨细胞向成骨细胞分化过程中起作用。

两端序列中有长反向重复序列，退火后形成“锅柄”结构，也不能被扩增;一端具有接头结构的DNA双链只能得到线性扩增:只有两端具有不同接头的DNA可得到指数性扩增产物。具体过程和原理如图3。3构建c洲人片段文库以及筛选特异表达基因构建文库时，PCR产物与T载体连接，再将连接质粒转化大肠杆菌，进行a互补筛选。用PcR法验证其中白色菌落克隆是否为含有插入片段的阳性克隆，然后将筛选出的阳性克隆质粒和菌种分别做好标记。通过virtualNorthernblot方法检测部分阳性克隆中插入片段的特异性，以

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本文编号：2715469