弓形虫多表位基因的构建及其在大肠杆菌和酵母系统中的初步表达

发布时间：2020-06-17 04:20

【摘要】： 弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种呈世界性分布的机会性致病原虫，所致的弓形虫病是免疫功能低下人群的重要并发症，有时甚至是致死病因；受弓形虫感染的孕妇可将其垂直传播给胎儿，造成孕妇流产、早产以及胎儿的死胎、畸胎等，存活的胎儿也往往伴随弓形虫性脑、眼疾病等严重的后遗症；弓形虫病又是一种人兽共患病，其爆发流行对畜牧业也造成极大损失。研制有效的弓形虫的疫苗和对感染弓形虫的患者（尤其是受感染的孕妇）做出早期诊断，是当前弓形虫病防治工作中的两大主题。在经历了减毒或弱毒疫苗后，针对弓形虫病的疫苗的研究目前主要集中在以保护性抗原为基础成分的蛋白疫苗和核酸疫苗上。以单一抗原成分构成的疫苗，往往因为其含有的淋巴细胞结合位点少、受机体 MHC限制性比较大，对形态多变、抗原成分复杂的虫体，难以形成有力攻击。而以多抗原成分及强免疫佐剂构成的多价复合疫苗，可以从多方位、多层次激发机体的免疫应答系统，提高机体的免疫保护力。由于弓形虫病缺乏特异性临床症状和体征，诊断仍是弓形虫病防治中一个突出的问题。目前临床上常用的是免疫学诊断方法。但同国外的一些试剂盒相比，我国目前还缺乏一种令人满意的诊断试剂盒，其主要原因是很难获得一种纯度高、尤其是抗原反应性强的虫体抗原。凭借现代分子生物学等手段，可以获得能够满足这种条件的重组抗原，从而提高试剂盒敏感性和特异性。本课题设计并合成了编码弓形虫多表位抗原的基因，分别在原核的大肠杆菌（E.coli）表达系统和真核的甲基营养型酵母（Methylotrophic yeasl）表达系统进行了初步表达，并对表达产物的抗原活性进行了初步分析。一、弓形虫多表位抗原的基因构建及合成根据文献报道的对弓形虫抗原表位的分析结果，分别从弓形虫保护性抗原SAGI、ROPZ、GRAZ中，选取了共4段、分别含有T细胞表位和（或）B细胞表位的抗原片段，以及1个含T细胞表位、起免疫增强作用的破伤风毒素片段P30，作为弓形虫多表位抗原的基本成分。为了使各片段在表达后仍保持各自独立的空间构象，发挥表位特有的作用，通过软件进行模拟分析和比较，在片段之间插入了适当数目的非极性氨基酸。在确定了弓形虫多表位抗原氨基酸序列的基础上，选取真核表达系统偏爱的密码子，得到编码这段复合抗原的碱基序列（基因序列）。该基因序列通过DNA合成仪一次性合成。酶切和测序结果证实该合成的基因片段与预先所设计的完全相符。二、弓形虫多表位基因在原核系统中的初步表达及对表达产物抗原活性的初步分析。将多表位抗原基因克隆入原核表达载体pRSETB，重组质粒转化大肠杆菌 BLZI（DE3），以 IPTG进行诱导，得到分于量为 14．4KD左右的目的蛋白产物。该蛋白产物以不可溶的包涵体形式存在。优化诱导条件以后，其表达量可占菌体总蛋白的20％左右。以抗弓形虫P30的单克隆抗体引3对该表达产物进行抗原活性检测，发现在不经复性的情况下，其即可被特异识别；随后将超声破菌所得的粗包涵体用于DipstiCk 法对弓形虫抗体的检测，检测结果表明弓形虫多表位基因的原核表达产物能被弓形虫感染的人阳性血清所特异识别。三、多表位基因在酵母系统中的初步表达及对表达产物抗原活性的初步分析将多表位抗原基因克隆入酵母表达载体 pPICZ Q C，重组质粒完全线性化后，以氯化缠法转化甲基营养型酵母X33，经甲醇诱导，得到大小约为60KD的特异条带。随后进行的免疫印迹反应中，其不能被单克隆抗体S3所识别，但可被弓形虫感染血清所特异识别，证明其具有一定的抗原惭件。－4－本课题在国内外首次报道了弓形虫多表位抗原的编码基因的构建，以及其分别在原核和真核体系的初步表达。所获得的表达产物分别具有一定的抗原活性。尤其经原核表达的重组抗原，不经复性即具有与抗体结合的强特异性反应性。这不仅为后面弓形虫病疫苗的研制提供了依据，也可以为弓形虫病诊断试剂盒的研制提供包被抗原。
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R382.5

【参考文献】