人ndrg家族成员cDNA的克

发布时间：2020-06-18 02:05

【摘要】： 人ndrg2基因(N-myc downstream-regulated gene 2)是本课题组于2000年从正常成人全脑cDNA文库中发现和获得的新序列。其全长为2,024bp，经BLAST相似性分析证明所得序列为一新基因(GenBank检索号：AF159092)。ndrg2基因含有16个外显子和15个内含子，定位于染色体14q11.2，编码一个含有357个氨基酸残基、分子量约为40kDa的蛋白质。初步研究显示，该基因可表达于多种组织中，并且是正常脑组织和胶质瘤的差异表达基第四军医大学硕士学位论文因。目前己报道该家族共有四个成员：ndrgl、ndrgZ、ndrg3禾 ndrg4，其中nd侣4又分为三个亚型：叫＊个B、n巾叶庄“『和叩r＊＊H。珐家族各成员厂的氨基酸残基序列同源性很高，但在各组织间的表达水平有明显差异。己知有多种因素可以影响 ndrg的表达水平，在施加同型半脐氨酸、致 DNA损伤性物质、地衣霉素hunicamycin＼应激刺激（缺氧、Niy等＼抑癌基因p53等因素的条件下，ndrgl 的表达上调；而雄激素、N－myc、C－myc 等因素可下调 ndrg 的表达。己有文献报道，在细胞的增箔分化、细胞氧化还原电势平衡的维持、阻抑肿瘤细胞扩散等过程中，ndrg和 ndrgZ发挥着重要作用［’””］。由于目前对于 ndrg家族的结构和功能性认识尚不全面，因此，克隆和表达n山g家族各成员并制备相应的特异性抗体则成为迫切而重要的基础性工作，有利于从总体上研究该家族各成员的生理功能。根据上述事实，本实验按如下方案展厂： 1．ndrg家族成员的cDNA克隆。提取人胎脑组织的总RNA，经反转录制备cDNA。依据GenBanLk登录的ndrg家族各成员序列分别合成了针对 ndfgl、ndrg3和 ndfg4B的引物，然后进行 PCR反应以扩增 DNA，回收和纯化PCR产物并将其插入到pMD 181载体中进行克隆后测序分析，用 BLAST 程序验证测序结果。 2．ndfg家族成员的原核表达。将测序下确的片段插入到pRSETA。 pGEX＊T、pPpoEX卫Tb等表达载体中，分别用 IPTG诱导表达，发现 pPROEX－HTbndygl所编码的NDRGI蛋白有高效可溶性表达。 3．NDRGI 蛋白的二级结构分析。融合表达的6HIS．NDRGI 蛋白经 NiNTA偶联的琼脂糖珠纯化后，进行圆h色性分析。发现在该分于中，几种蛋白质二级结构所占比列如下：。螺旋：23石9入p片层：18石％，转角： 25．7％，无规则卷曲：32刀％，这与计算机程序预测的结果相近。 4．抗人 NDRG家族的多克隆抗体制备。用可溶性的 6HIS－NDRG蛋白 4 第四军医大学硕士学位论文免疫家兔获得了高效价的兔抗人 NDRG多克隆抗血清，利用固定于硝酸纤维素膜上的NDRGI抗原进行亲和吸附，以纯化抗血清，提高了NDRGI多克隆抗体的特异性，并用此纯化的抗体进行了免疫组化和 Western捡测。出于＊＊＊G家族各成员间氨基酸组成有很高的同源性，此抗体在识别＊D＊GI。 NDRGZ、NDRG3和 NDRG4时存在交叉，表明己获得抗人NDRG家族的多芜隆抗体。 5．抗人NDRG家族寡肽的多克隆抗体制备。山于抗人NDRG家族的多是隆抗体不能很好地区分NDRG1、NDRGZ、NDRG3和NDRG4，按各亚型分于氦基酸残基序列中特异的肽段合成的寡肽作为半抗原，与KLH偶联后兔疫家兔，以制备特异性的抗寡肽抗体。B前免疫家兔的抗体滴度约为1：3 200，继续加强免疫，可望获得具有高度特异性的抗体，以特异地识别NDRGI。 NDRGZ、NDRG3和 NDRG4各亚型分子。
【学位授予单位】：中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：Q78
【图文】：

表达形式,融合蛋白

(1)6His.NDRG3和6His.NDR以一B融合蛋白的表达形式分析6His一DRG3的理论相对分子量约为43.0kDa，经IPTG诱导表达，获得的表达蛋白大小与预期基本相符(左箭头所指)。图5一a中1、2、3三个泳道分别代表6His入DRG3融合蛋白在总蛋白、上清和沉淀中的分布，可见6His一DRG3融合蛋白主要分布在沉淀中，以包涵体的形式存在。6His一NDRG4一B的理论相对分子量约为41.0kDa，经IPTG诱导表达，获得的表达蛋白大小与预期基本相符(右箭头所指)。图5一a中第4、5、6三个泳道分别代表6His一NDRG4一B融合蛋白在总蛋白、上清和沉淀中的分布，可见6His一DR以一B融合蛋白主要分布在沉淀中，以包涵体的形式存在。123CM456一咖一黔黔涵盆鹅翻嘛荡嘛一少毛、翎畔净续一廿狱鲍二妙阅一-笠叶食夔_矍暨图5一a6His一NDRc3、6nis一NDRe李B的表达形式分析Fig.5一aSDSPAGEanalysisofexPr

融合蛋白,形式分析,亲和纯化,相对分子量

(2)6His.NDRGI融合蛋白的表达形式分析及纯化6His.NDRGI融合蛋白的理论相对分子量为43.0叨a，经IPTG诱导表达，获得的表达蛋白大小与预期相符(箭头所指)。图5一b中第1、2、3三个泳道分别代表6His.NDRGI融合蛋白在总蛋白、上清和沉淀中的分布，见6His.NDRGI融合蛋白在上清和沉淀中均有分布，上清中表达的可溶性蛋白约占菌体总蛋白的28%。可溶性的6His-NDRGI融合蛋白可以用来做进一步的纯化。kDaMC12397.166.243.0纂纂鬓撮黔瞥缈壑肇一31.0黔鹦;粤考撇瞬·、嵌片兮州矽一闷曰门..口...闷.‘....脚...一.，........图5一b6His一NDRGI的可溶性表达Fig.5-bSDS一PAGEanalysisofexPressionandsolubilityof6His一NDRGIfusionprotein.M:Proteinmarker:C:PPROEX一HTbinDHSQindueedbyIPTGinLBmedia:l:PRoEX一HTb一nd飞1inDHSQindueedbyIPTG:2:suPernatantofbacteriallysatecontaining6His一DRGIfusionProtein):3:PreeiPitateofbacteriallysate(eontainingH15一DRG1fusionProtein);表达的6His.NDRGI融合蛋白质经Ni一TA偶联的琼脂糖珠亲和纯化;在咪哇浓度为200nuno比和250~。比的洗脱液中得到较高纯度蛋白质。

【参考文献】