人肿瘤坏死因子α转基因关节炎小鼠模型构建及应用

发布时间：2017-03-28 07:16

  本文关键词：人肿瘤坏死因子α转基因关节炎小鼠模型构建及应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:人肿瘤坏死因子α(hTNFα)在类风湿性关节炎(RA)病程中起着刺激和放大炎症的关键作用,药物阻断其活性可有效缓解RA病情,是RA治疗中重要的药物靶点。本研究通过构建hTNFα转基因小鼠,并从临床症状、病理特征和细胞因子检测等方面系统性地对转基因阳性小鼠的表型进行评价,筛选获得具有类风湿性关节炎临床特征的转基因小鼠模型,并在此基础上,应用该模型对临床前(AT132)和市售(Adalimumab和Infliximab)的hTNFα单抗药物以及化学合成药物(盐酸青藤碱)开展药效学评价实验,为该hTNFα转基因关节炎小鼠模型应用于关节炎新药筛选提供实验依据。方法:利用重组hTNFα/β-球蛋白(globin)转基因载体,获得hTNFα转基因阳性小鼠,通过定期对该小鼠体重和关节炎临床症状进行评价;观察小鼠病程发展过程中关节组织和器官病理改变;hTNFα在小鼠关节组织及器官中的免疫组织化学表达定位;对小鼠血清和关节滑膜中hTNFα、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-15、IL-17、m TNFα、IFNγ和GM-CSF等细胞因子进行流式细胞定量分析,最终筛选获得具有类风湿性关节炎临床特征的hTNFα转基因小鼠模型。应用该模型,通过临床观察、病理检测以及hTNFα定量分析,对临床前(AT132)和市售(Adalimumab和Infliximab)的hTNFα单抗药物以及化学合成药物(盐酸青藤碱)开展抗RA药效学评价实验、抗RA量效分析等实验,为该hTNFα转基因关节炎小鼠模型应用于关节炎新药筛选提供实验依据。结果:1.建立htnfα转基因关节炎小鼠模型。通过基因组pcr鉴定得到的fvb背景htnfα转基因阳性小鼠均表现出关节炎症状。体重:较fvb近交系小鼠,在出生后4~18周的观察期内,htnfα转基因小鼠体重增长缓慢。临床症状:随年龄增长,htnfα转基因小鼠表现出关节肿胀变形,握力下降,整体灵活性减低,关节僵硬,活动严重受损等关节炎相关的临床症状。病理特征:htnfα转基因小鼠关节在膝关节、踝关节和腕关节等多个关节出现类风湿性关节炎的病理改变,主要表现为炎性细胞的浸润,滑膜增生,血管翳和破骨细胞的出现,滑膜细胞纤维化,最终导致软骨和骨的破坏。而其他组织器官未见异常。htnfα免疫组化定位:关节滑膜组织异常高表达htnfα,同时,其他部分组织器官中也存在htnfα阳性反应。细胞因子检测:与wt鼠比较,htnfα转基因鼠关节滑膜中htnfα表达异常升高(p0.01),血清中htnfα以及血清和关节滑膜中的il-1α、il-1β、il-2、il-4、il-5、il-6、il-12、il-15、il-17、鼠源tnfα、ifnγ和gm-csf表达未见显著差异。2.htnfα转基因关节炎小鼠模型应用。at132:抗htnfα单抗药物Αt132(30mg/kg)治疗htnfα转基因关节炎小鼠10周,htnfα转基因关节炎小鼠症状被抑制,关节滑膜组织中htnfα表达量显著降低,药物治疗有效。对at132进行量效关系评价后发现,当给药剂量为1.25mg/kg和0.625mg/kg时仍能表现很好的临床治疗效果,当给药剂量降低到0.312mg/kg和0.156mg/kg时,at132治疗无效。实验结果表明,对htnfα小鼠有效的Αt132给药剂量为≥0.625mg/kg。adalimumab:不同浓度抗htnfα单抗药adalimumab(12mg/kg、6mg/kg、3mg/kg)治疗htnfα转基因关节炎小鼠8周,htnfα小鼠关节炎症状均被抑制,关节滑膜组织中htnfα表达量显著降低,药物治疗有效。infliximab:不同浓度抗htnfα单抗药infliximab(60mg/kg、30mg/kg、15mg/kg)治疗htnfα转基因关节炎小鼠8周,htnfα小鼠关节炎症状均被抑制,关节滑膜组织中htnfα表达量显著降低,药物治疗有效。.盐酸青藤碱:药物治疗htnfα转基因关节炎小鼠4周,htnfα小鼠关节炎症状未被抑制,关节滑膜组织中htnfα表达量无显著差异,该小鼠对青藤碱治疗不敏感。结论:1.成功建立了hTNFα转基因关节炎小鼠模型,并获得了该模型在体重、临床表现、病理特征、细胞因子水平等与关节炎密切相关的重要表型指标,为模型应用奠定了基础。2.利用该模型,系统地对临床前hTNFα单抗药物AT132进行了系统地药效学和量效关系评价,发现AT132((30 mg/kg))治疗hTNFα转基因关节炎小鼠有效,且最低起效浓度为0.625mg/kg。3.利用该模型对市售用于RA治疗的hTNFα单抗药物(Adalimumab和Infliximab)以及非hTNFα单抗药物(盐酸青藤碱)进行药效学评价后,证明本研究所使用单抗药物和剂量在该模型上均有效,而非单抗药物对该模型的临床症状并无改善作用。
【关键词】：人肿瘤坏死因子(hTNFα)转基因关节炎小鼠模型 ΑT132 Infliximab Adalimumab 盐酸青藤碱 药效评价
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5;R-332
【目录】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 1 前言13-17
• 1.1 研究背景13-15
• 1.2 研究目的15
• 1.3 研究内容15-17
• 第一部分：h TNFα转基因关节炎小鼠模型构建17-33
• 2 实验材料17-18
• 2.1 主要仪器设备17
• 2.2 主要试剂17-18
• 3 实验方法18-23
• 3.1 hTNFα转基因小鼠模型构建18
• 3.2 hTNFα转基因阳性小鼠的鉴定18-19
• 3.3 hTNFα转基因小鼠日常状态的观察及关节炎指数评定19
• 3.4 hTNFα转基因小鼠标本的采集以及处理19-20
• 3.5 hTNFα转基因小鼠关节、心、肝、脾、肺、肾、脑的病理检测20-21
• 3.6 免疫组化法检测h TNFα转基因小鼠中h TNFα的表达21-22
• 3.7 流式细胞仪检测h TNFα转基因小鼠滑膜和血清中IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-15、IL-17、TNFα、IFNγ和GM-CSF的表达水平22-23
• 3.8 统计学处理23
• 4 实验结果23-29
• 4.1 hTNFα转基因小鼠的鉴定23
• 4.2 转基因小鼠的体重变化23-24
• 4.3 转基因小鼠关节炎的临床症状24-25
• 4.4 转基因小鼠的病理改变25-26
• 4.5 免疫组织化学方法检测转基因小鼠各脏器的h TNFα表达26-28
• 4.6 免疫细胞因子的变化28-29
• 5 讨论29-33
• 5.1 hTNFα转基因关节炎小鼠模型的构建29-30
• 5.2 hTNFα转基因关节炎小鼠病理学改变30-31
• 5.3 hTNFα转基因关节炎小鼠的细胞因子变化31-33
• 第二部分h TNFα转基因关节炎小鼠模型应用33-50
• 2 实验材料33
• 2.1 主要仪器设备33
• 2.2 主要药品33
• 2.3 主要试剂33
• 2.4 实验动物及饲养条件33
• 3 实验方法33-36
• 3.1 实验分组、给药方式和剂量33-35
• 3.2 hTNFα小鼠日常状态的观察及关节炎评分35
• 3.3 hTNFα小鼠标本的采集以及处理35
• 3.4 hTNFα转基因关节炎小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、关节病理检测35
• 3.5 流式细胞仪检测血清中IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-15、IL-17、TNFα、IFNγ 和GM-CSF的表达水平检测35
• 3.6 统计学处理35-36
• 4 实验结果36-47
• 4.1 药物抑制hTNFα转基因小鼠关节炎临床36-41
• 4.2 AT132治疗后对hTNFα转基因小鼠关节及重要组织器官病理影响41-45
• 4.3 TNFa单抗药物治疗对h TNFα转基因小鼠关节滑膜和血清中hTNFα表达的影响45-47
• 5 讨论47-50
• 5.1 ΑT132对h TNFα转基因关节炎小鼠的影响47-48
• 5.2 不同浓度Infliximab治疗hTNFα转基因关节炎小鼠效果48-49
• 5.3 不同浓度Adalimumab治疗hTNFα转基因关节炎小鼠效果49
• 5.4 盐酸青藤碱治疗h TNFα转基因关节炎小鼠效果49-50
• 结论50-51
• 参考文献51-56
• 综述56-64
• 参考文献61-64
• 致谢64-65
• 附录一：缩写词中英文对照65-66
• 附录二：攻读学位期间完成论文及获奖情况66

【共引文献】

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 王维;淋巴细胞JAM-A在类风湿关节炎的作用研究[D];云南大学;2015年

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本文编号：271874