人类LIGHT胞外区基因的克隆及原核表达条件初探

发布时间：2020-06-24 15:50

【摘要】：目的: 1998年Mauri和Zhai等相继发现了肿瘤坏死因子超家族的第14个成员—LIGHT（homologous to lymphotoxins, inducible, competes with HSV glycoprotein D for HVEM, expressed by T lymphocyte），并报道了其分子量、染色体定位及在体外试验中激活NF-κB转位、刺激T细胞增生和抑制人结肠癌细胞株HT-29生长的生物学活性。LIGHT mRNA高表达于脾脏、激活的T细胞和巨噬细胞。在体外试验中，佛波酯（PMA）和植物血凝素（PHA）或PMA和离子霉素均能诱导人外周血单个核细胞（PBMC）LIGHT mRNA表达。同其他TNF超家族成员一样，LIGHT蛋白为典型的Ⅱ型跨膜蛋白，其胞外区近膜端可被金属蛋白激酶E酶解并脱落形成分子量约为24KD的可溶性蛋白（hsLIGHT）。该蛋白与分布于不同细胞表面的不同受体相互作用发挥不同的生物学作用：一方面，hsLIGHT与分布于肿瘤细胞（如人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、人结肠癌细胞株HT-29等）表面的淋巴毒素受体（lymphotoxin ( recepter，LT(R）相互作用，经非半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase）依赖途径诱导肿瘤细胞的凋亡；另一方面，其与T细胞表面的单纯疱疹病毒进入介导物（herpesvirus entry mediator, HVEM）相互作用，通过非CD28依赖途径共刺激 WP=4 T细胞的增殖、活化。另外其在树突状细胞（dendritic cells, DCs）的分化成熟、胸腺细胞的阴性选择、细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）介导的抗肿瘤效应、自身免疫的发生、器官移植的免疫排斥中也起着重要作用。鉴于：（1）与hsLIGHT结合后介导细胞凋亡的LT(R仅表达在肿瘤细胞表面，而在其它正常细胞不表达或低表达；（2）T细胞表面的相应受体与hsLIGHT结合后可刺激T细胞的活化、增殖，而T细胞在机体的抗肿瘤免疫反应中起着重要作用；（3）hsLIGHT能发挥与全长人LIGHT（hLIGHT）相同的生物学作用，而hsLIGHT片段较小，易于克隆、表达，且表达产物容易纯化等原因。本研究对hsLIGHT基因进行了克隆；构建了其原核重组融合蛋白表达质粒pGEX-4T-2/hsLIGHT；选用具有成本低、蛋白表达量高、容易纯化等优点的大肠杆菌表达系统，对其原核融合蛋白表达条件进行了初步探讨。旨在进一步探讨hsLIGHT的抗肿瘤生物学活性，探索肿瘤的免疫治疗新方法，为hsLIGHT蛋白用于临床肿瘤治疗提供实验依据，并为此种生物制剂的进一步生产、开发创造可能性。方法：取培养的人早幼粒白血病细胞（HL60），分别加入终浓度为68 ng/ml的佛波酯（PMA）、0.3 μg/ml的离子霉素（ionomycin），37℃，5% CO2培养24h后，提取细胞总RNA，用自行设计的hsLIGHT特异性引物进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增。将扩增产物与pGEM-T Easy载体连接，转化E.coli DH5α，在含氨苄青霉素（Amp）的2YT培养基上筛选重组子，提取质粒进行酶切鉴 WP=5 定和测序。用EcoR I和Xho I将目的片断从pGEM-T Easy/hsLIGHT质粒切下，与经过相同酶切的原核表达载体pGEX-4T-2连接，经过转化、筛选和酶切鉴定后，构建成原核表达重组质粒pGEX-4T-2/hsLIGHT。挑选阳性重组质粒转化的E.coli BL21，在含氨苄青霉素的2YT液体培养基中培养至OD600=0.5~1.0。加入不同浓度的IPTG诱导不同时间后，经SDS-PAGE电泳观察融合蛋白（GST-hsLIGHT）的表达，并利用Western Blot方法确定目的蛋白的存在。对阳性克隆进行扩大培养，从1L细菌培养液中提取包涵体及上清蛋白，经SDS-PAGE电泳分析融合蛋白的表达，并用双缩脲法测定包涵体蛋白含量。结果：（1）经测序可见构建的pGEM-T Easy/hsLIGHT重组质粒内插入片断序列与Genbank报道的人LIGHT基因胞外区序列完全一致。（2）以构建的pGEX-4T-2/hsLIGHT重组质粒转化E.coli BL21，同时设pGEX-4T-2空质粒转化的E.coli BL21和未转化任何质粒的E.coli BL21作为阴性对照组。加入终浓度分别为0.1 mmol/L、1 mmol/L、2.5 mmol/L、5 mmol/L的IPTG ，37℃诱导2h、4h、6h、8h后，经SDS-PAGE电泳观察可见：未经IPTG诱导的E.coli BL21均无GST蛋白和GST-hsLIGHT融合蛋白的表达；经IPTG诱导的转入pGEX-4T-2质粒的E.coli BL21，在分子量约为26KD（GST）处可见一条蛋白条带；经IPTG诱导的转入pGEX-4T-2/hsLIGHT重组质粒的E.coli BL21，在分子量约为47KD处可见一条蛋白条带，与GST-hsLIGHT融合蛋白分子量一致，且经不同浓度的IPTG诱导4h后均出现阳 WP=6 性条带（GST-hsLIGHT）。Western Blot进一步证实该条带确为GST-hsLIGHT融合蛋白。（3）提取经IPTG诱导表达的细菌包涵体，经SDS-PAGE电泳发现，GST-hsLIGHT融合蛋白主要存在于细菌包涵体中，而上清中未见阳性蛋白（GST-hsLIGHT）条带。经蛋白定量结果显示，1L菌液可获得包涵体蛋白16.5mg。结论：本研究成功完成了人LIGHT胞外区（hsLIGHT）基因的克隆并构建了hsLIGHT原核表达质粒pGEX-4T-2/hsLIGHT；以此质粒转化的E.coli BL21，在IPTG诱导下，成功表达了融合蛋白GST-hsLIGHT。为进一步研究LIGHT的抗肿瘤生物学活性奠定了良好的基础；为今后将LIGHT作为一种治疗肿瘤的生物制剂进一步生产开发提供了重要保证。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392

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