【摘要】：丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化(LC)，甚至肝细胞癌(HCC)。HCV非结构蛋白3(NS3)蛋白由631个氨基酸组成，相对分子质量为70KDa，在HCV感染的慢性化、致纤维化、致癌作用中非常重要。 为研究HCV NS3蛋白的结合蛋白，我们用酵母双杂交技术筛选表达型cNDA白细胞文库中与丙型肝炎病毒NS3蛋白结合蛋白的基因。首先用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS3基因，连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒，转化酵母细胞AH109并在其内表达，然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落，增菌后提出质粒，转化入大肠杆菌(DH5α)，提出质粒并测序，进行生物信息学分析。结果成功克隆出NS3基因并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺(SD／-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落18个，其中4个真核细胞翻译延伸因子2；2个免疫球蛋白λ轻链；1个肌动蛋白β；1个铁蛋白轻多肽；1个(丝裂原)活化蛋白激酶3；2个肌球蛋白因子1；1个白细胞介素2受体β；1 第四军医大学硕士学位论文 个富含精氨酸/丝氨酸剪切因子6:1个组织蛋白酶S;1个2’一5’- 寡腺甘酸合成酶类似物:1个缺失精子缺乏相关蛋白2;1个CNNZ; 1个新基因。上述结果表明已成功克隆出HCV NS3的结合蛋白，为 进一步研究HCV的作用提供了新线索。 为了探索HCV NS3病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我 们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和未转染的肝母细胞 瘤细胞系HepGZ进行分析。首先根据HCv一H病毒株序列设计、合 成序列特异性的引物。以含有全长Hcv一H株。DNA的pBRTM一30n 质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCV NS3 编码基因片段克隆到TA载体中进行核昔酸序列的测定，构建真核 表达载体pcDNA3一NS3。然后以pcDNA3一NS3转染肝母细胞瘤细胞系 HepGZ，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。 最后应用分子生物学技术，结合生物信息学技术 (bioinformaties)，克隆HCV Ns3反式激活作用的新的靶基因。 结果显示构建的真核表达载体pcDNA3一NS3经过限制性内切酶作图 分析和核昔酸序列分析证实正确无误。应用分子克隆技术结合生 物信息学技术克隆获得NS3反式激活的新型靶基因，命名为 NS3TP6。新基因的编码基因序列全长为414个核昔酸(nt)，编码 产物由138个氨基酸残基(aa)组成，是一种典型的病毒基因组 编码的具有反式激活作用的蛋白。研究还表明，微矩阵技术是分 析基因表达谱变化的有效的高通量技术。发现的HCV NS3反式激 活作用的新的靶基因，并成功克隆了其中的NS3TP6，为阐明HCV Ns3蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。 为研究NS 3TP6的结合蛋白，用酵母双杂交技术筛选白细胞中 与Ns3TP6蛋白结合蛋白的基因。首先用多聚酶链反应(P CR)法 扩增HCV NS3TP6蛋白基因，连接入酵母表达载体pGBKT一7中构建 诱饵质粒，转化酵母细胞AH109并在其内表达，然后与转化了人 白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基 第四军医大学硕士学位论文 上进行双重筛选阳性菌落，增菌后提取质粒，转化入大肠杆菌，提 取质粒并测序，进行生物信息学分析。结果成功克隆出Hcv NS3TP6 蛋白基因并在酵母细胞中表达，配合后选出在四缺 (SD产Trp一Leu一Ade一HIS)培养基和铺有X一a一半乳糖(X一a一gal) 的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落共7个，其中3 个人类白细胞CD14抗原，1个人类免疫球蛋白入轻链，3个人类 推定蛋白基因(AC 1 24014，AC097504，AC023785)。以上实验成功 克隆出NS3TP6蛋白的结合蛋白，为进一步研究HCV的作用提供了 新线索。 为了进一步研究NS3TP6可能的分子生物学功能，我们应用基 因芯片技术，检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活 基因NS3TP6的表达对肝母细胞瘤细胞HepGZ基因表达谱的影响。 以分子生物学技术构建NS3TP6的真核表达载体 peDNA3.1。)一NS3TP6，以表达质粒peDNA3.1卜)一NS3TP6转染HepGZ 细胞，以空载体poDNA3.1。)为平行对照，制备转染后的细胞裂解 液，提取瓜RNA。应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检 测和分析。结果显示，HepGZ细胞经转染NS3TP6后，有7条基因 表达增强，38条基因表达降低。应用基因表达谱芯片成功筛选了 NS3TP6的反式调节基因，为进一步阐明NS3TP6的反式激活作用及 免疫调节机制提供了新的依据。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346
【参考文献】
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