血管活性肠肽真核表达质粒的构建及鉴定

发布时间：2020-06-28 15:57

【摘要】：目的构建一种具有生物学活性的血管活性肠肽(VIP)的真核表达质粒。方法利用RT-PCR从小鼠胸腺淋巴细胞中克隆有信号肽序列的VIPcDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1,构建含VIP的重组质粒pcDNA3.1-VIP,转染COS-7细胞,用ELISA和Westernblot鉴定表达的蛋白,细胞因子释放抑制法测定生物学活性。结果经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为带有信号肽序列的VIP基因;经转染的COS-7细胞表达VIP蛋白,并能有效地抑制巨噬细胞的TNF-α释放。结论成功构建了能够表达具有生物学活性的真核表达质粒pcDNA3.1-VIP。
【图文】：

EcoRⅠ双酶切后,在约160 bp处得到一片段,符合插入的目的片段长度,另一大片段产物为切开的pcDNA3.1质粒DNA(图2)。重组pcDNA3.1-VIP进一步经测序证实,插入片段为带有信号肽的VIP cDNA(图3)。·149·第2期张松照,等.血管活性肠肽真核表达质粒的构建及鉴定　　

的瞬时表达　Westorn blot分析结果表明经pcDNA3.1-VIP转染的COS-7细胞及其培养上清中均有VIP多肽的存在(图4); ELISA结果显示培养上清中VIP含量达1 ng/ml。而转染空质粒pcDNA3.1的细胞及上清液中均未见有VIP产物的表达。这说明带有信号肽的VIP重组质粒在转染的COS-7细胞中的表达产物可分泌至胞外。2.4　表达产物VIP蛋白的生物学活性鉴定　据文献报道[6],VIP能抑制M 经LPS诱导的TNF-α、IL-1等细胞因子的产生。本实验观察了COS-7细胞转染M 经LPS诱导的TNF-α产生的影响。结果显示,经pcDNA3.1-VIP转染的COS-7细胞上清能显著抑制M 经LPS诱导的TNF-α的产生,且呈剂量依赖性,与对照组相比P<0.01,表明该重组质粒的表达产物具有生物学活性;VIP的中和抗体能中和此等抑制效应(图5)。图4　表达产物的Westorn blot分析Fig.4　Westorn blot analysis of expressed product1: Supernatant of cells transfected withpcDNA3.1-VIP;2:Lysate of cells transfected withpcDNA3. 1-VIP; 3, 4: Supernatant and lysate ofcells transfected with pcDNA3.13　讨　论由于VIP神经肽基因的复杂性和表达的多样性,到目前为止

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本文编号：2733200