缺氧时大鼠心脏成纤维细胞与细胞外基质相互作用及机制的研究
发布时间：2020-07-06 15:20
【摘要】： 在高原环境下,机体缺氧可引发以右心室肥大为主的心肌组织结构改变,最终发展为高原心脏病。高原心脏病是高原地区的多发病,而我国是世界上高原地域最辽阔、居住人口最多的国家,因此关于高原心脏病发生机制和防治的研究在我国具有特别重要的战略和经济意义。 目前认为心肌重塑是心肌在损伤因素作用下,心功能由代偿发展为失代偿的结构基础,而心肌纤维化是此过程中的重要环节;近年来的研究表明机体缺氧也可引发心肌纤维化,但是缺氧引发心肌纤维化的机制国内外尚未见系统和深入的研究。组织纤维化的细胞生物学基础是成纤维细胞激活导致间质中以胶原蛋白为主的细胞外基质(ECM)蛋白过度沉积,已有较多的研究结果显示缺氧可促进不同类型的成纤维细胞向纤维增生的细胞表型转换,表现为胶原蛋白mRNA的表达和蛋白合成增加,细胞出现肌成纤维细胞表型,因此缺氧是组织纤维增生的一个重要刺激因素。由此可以推测,缺氧对心脏成纤维细胞(CFs)的功能调控可能是导致缺氧性心肌纤维化的重要机制。 应当强调的是在组织纤维增生过程中,ECM蛋白的变化可通过整合素的介导调控细胞的功能,这种反馈调节作用是进一步影响ECM蛋白代谢的重要因素。对于CFs,一方面它是心肌ECM蛋白代谢调控的中心环节;另一方面,ECM蛋白的变化又可以反馈调控CFs的生长和功能,所以CFs与ECM蛋白的交互作用是影响原有的“细胞-ECM”稳态的关键所在,也是决定心肌重塑进行性发展的重要机制。因此我们认为,机体缺氧时,缺氧所引发的CFs功能调节是导致心肌纤维化的一个重要途径,而由整合素介导的“CFs-ECM”相互作用是缺氧调控CFs功能的一个关键环节,从而在高原心脏病的发生发展过程中具有重要的调控作用。 为了深入、全面地了解缺氧时CFs与ECM之间的相互作用,我们利用离体培养的成年大鼠CFs,首先研究了缺氧(2%O2)对CFs纤维增生性应答的影响,包括I、III胶原蛋白α肽链mRNA的表达和胶原蛋白合成、纤维粘连蛋白及其胚胎型异构体mRNA的表达、骨桥蛋白mRNA的表达和蛋白水平、以及CFs表型(肌成纤维细胞表型)等的变化;同时研究了缺氧对CFs整合素表达及其相关信号通路的影响;并在此基础上,初步研究了缺氧时CFs纤维增生性应答的变化同整合素信号通路的关系。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R363
【图文】：
抗原及肌动蛋白免疫组化染色阴性[26]。一、缺氧对大鼠 CFs ECM 蛋白 mRNA 表达的影响GAPDH mRNA 的表达在缺氧各时相并无明显变化，也表明各组用于 RT-PCR 的原始模板量（细胞总 RNA 样本）基本一致，结果见图 1（“照片部分”——以下为照片的图均在论文“照片部分”）。而 I、III 型胶原蛋白 α 肽链、FN 和 OPN mRNA 的 RT-PCR产物均出现明显差别，提示各目的片段（mRNA）的表达均发生了显著变化，具体如下：（一）缺氧对大鼠 CFs I、III 型胶原蛋白 α 肽链 mRNA 表达的影响I 型胶原 α 肽链 mRNA 的表达自缺氧第 12h 开始表达明显增加，持续至缺氧第 72h，结果见图 2-1；III 型胶原 α 肽链 mRNA 的表达自缺氧第 6h 即开始明显增加，持续至缺氧第 72h，结果见图 2-2。为排除细胞自身生长特性对胶原蛋白 α 肽链 mRNA 表达的影响，取 I、III 胶原 α肽链 mRNA 表达均发生明显变化的第 12h 时相，设置平行的常氧孵育 12h 对照组进行实验，结果见图 2-3。CFs 缺氧 12h 后，462bp 和 463bp 的条带密度仍显著高于相应的常氧组，而常氧组与缺氧组的 408bp 条带（内参照 GAPDH）强度基本一致。实验以不同批次的细胞独立进行 3 次，扩增产物的光密度图像分析结果见图 2-4。
第三军医大学博士学位论文 开始又明显回落，但仍旧高于 0h 的基础水平，结果见图 3-1。取改变最为明显的缺氧第 6h 观察 FN mRNA 表达的可变剪接变化，可见缺bp 的条带密度（EIIIA+-FN mRNA 的 RT-PCR 产物）相对于 595bp 和 325bp 两度总和的百分比——即 EIIIA+-FN mRNA 表达水平占总 FN mRNA 表达水平显增加；缺氧时 427bp 的条带密度（EIIIB+-FN mRNA 的 RT-PCR 产物）相bp 和 154bp 两个条带密度总和的百分比——即 EIIIB+-FN mRNA 表达水平占总NA 表达水平的比例亦明显增加，见图 3-2。因此提示，缺氧不但上调 CFs 总NA 的表达，还促进 EIIIA+-FN 和 EIIIB+-FN 的 mRNA 表达。实验以不同批次立进行 3 次，扩增产物的平均光密度分析结果见图 3-3，扩增产物的光密度显示，缺氧组 EIIIA+-FN 和 EIIIB+-FN mRNA 的 RT-PCR 扩增产物较常氧组了 71.4%和 50.0%。
二、缺氧对大鼠 CFs 胶原蛋白及总蛋白合成速率的影响CFs 在缺氧第 24h、48h 时，培养基中胶原酶敏感的3H-脯氨酸掺入较常氧组，分别增加 132%和 163%（表 1）。而低氧组和常氧组的细胞内3H-亮氨酸掺4h 时基本相同，低氧 48h 细胞的3H-亮氨酸掺入率较常氧组有所降低，但差计学支持（P>0.05）（表 2）。细胞计数的结果表明低氧组与常氧组的细胞数量基本一致（表 3），所以实验胶原酶敏感的3H-脯氨酸掺入率和3H-亮氨酸掺入率可排除细胞数量的影响。表. 1 缺氧对大鼠 CFs 胶原酶敏感的3H-脯氨酸掺入率(dpm)的影响（ x ± s,n=3, each conducted in triplicate or quadruplicate）TimeGroup24h 48hControl 209.92±114.24 468.15±95.35Hypoxia 488.37±88.95*1233.18±232.36**24h：方差齐性检验：P=0.534；*t=3.331，P=0.029 vs 24h Control。48h：方差齐性检验：P=0.152；**t=5.276，P=0.006 vs 48h control。
本文编号：2743816
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R363
【图文】：
抗原及肌动蛋白免疫组化染色阴性[26]。一、缺氧对大鼠 CFs ECM 蛋白 mRNA 表达的影响GAPDH mRNA 的表达在缺氧各时相并无明显变化，也表明各组用于 RT-PCR 的原始模板量（细胞总 RNA 样本）基本一致，结果见图 1（“照片部分”——以下为照片的图均在论文“照片部分”）。而 I、III 型胶原蛋白 α 肽链、FN 和 OPN mRNA 的 RT-PCR产物均出现明显差别，提示各目的片段（mRNA）的表达均发生了显著变化，具体如下：（一）缺氧对大鼠 CFs I、III 型胶原蛋白 α 肽链 mRNA 表达的影响I 型胶原 α 肽链 mRNA 的表达自缺氧第 12h 开始表达明显增加，持续至缺氧第 72h，结果见图 2-1；III 型胶原 α 肽链 mRNA 的表达自缺氧第 6h 即开始明显增加，持续至缺氧第 72h，结果见图 2-2。为排除细胞自身生长特性对胶原蛋白 α 肽链 mRNA 表达的影响，取 I、III 胶原 α肽链 mRNA 表达均发生明显变化的第 12h 时相，设置平行的常氧孵育 12h 对照组进行实验，结果见图 2-3。CFs 缺氧 12h 后，462bp 和 463bp 的条带密度仍显著高于相应的常氧组，而常氧组与缺氧组的 408bp 条带（内参照 GAPDH）强度基本一致。实验以不同批次的细胞独立进行 3 次，扩增产物的光密度图像分析结果见图 2-4。
第三军医大学博士学位论文 开始又明显回落，但仍旧高于 0h 的基础水平，结果见图 3-1。取改变最为明显的缺氧第 6h 观察 FN mRNA 表达的可变剪接变化，可见缺bp 的条带密度（EIIIA+-FN mRNA 的 RT-PCR 产物）相对于 595bp 和 325bp 两度总和的百分比——即 EIIIA+-FN mRNA 表达水平占总 FN mRNA 表达水平显增加；缺氧时 427bp 的条带密度（EIIIB+-FN mRNA 的 RT-PCR 产物）相bp 和 154bp 两个条带密度总和的百分比——即 EIIIB+-FN mRNA 表达水平占总NA 表达水平的比例亦明显增加，见图 3-2。因此提示，缺氧不但上调 CFs 总NA 的表达，还促进 EIIIA+-FN 和 EIIIB+-FN 的 mRNA 表达。实验以不同批次立进行 3 次，扩增产物的平均光密度分析结果见图 3-3，扩增产物的光密度显示，缺氧组 EIIIA+-FN 和 EIIIB+-FN mRNA 的 RT-PCR 扩增产物较常氧组了 71.4%和 50.0%。
二、缺氧对大鼠 CFs 胶原蛋白及总蛋白合成速率的影响CFs 在缺氧第 24h、48h 时，培养基中胶原酶敏感的3H-脯氨酸掺入较常氧组，分别增加 132%和 163%（表 1）。而低氧组和常氧组的细胞内3H-亮氨酸掺4h 时基本相同，低氧 48h 细胞的3H-亮氨酸掺入率较常氧组有所降低，但差计学支持（P>0.05）（表 2）。细胞计数的结果表明低氧组与常氧组的细胞数量基本一致（表 3），所以实验胶原酶敏感的3H-脯氨酸掺入率和3H-亮氨酸掺入率可排除细胞数量的影响。表. 1 缺氧对大鼠 CFs 胶原酶敏感的3H-脯氨酸掺入率(dpm)的影响（ x ± s,n=3, each conducted in triplicate or quadruplicate）TimeGroup24h 48hControl 209.92±114.24 468.15±95.35Hypoxia 488.37±88.95*1233.18±232.36**24h：方差齐性检验：P=0.534；*t=3.331，P=0.029 vs 24h Control。48h：方差齐性检验：P=0.152；**t=5.276，P=0.006 vs 48h control。
【参考文献】
相关期刊论文 前4条
1 许蜀闽,王培勇,马红英;连二亚硫酸钠在建立培养细胞的无氧环境中的应用[J];第三军医大学学报;2005年04期
2 刘兵,谢增柱,王仕军;缺氧对大鼠心肌胶原网架改建的作用[J];第三军医大学学报;1999年09期
3 谢增柱,刘福玉,万强;缺氧性右心室肥大发生机制和防治的研究[J];西藏医药杂志;1996年03期
4 严俊,高钰琪,谢增柱;低氧促进大鼠心脏成纤维细胞DNA合成及Ⅰ、Ⅲ胶原mRNA表达[J];中国应用生理学杂志;2004年02期
本文编号：2743816
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