外伤后细菌性致死性肉芽肿致病菌分子生物学鉴定及动物模型的初步构建

发布时间：2020-07-07 06:42

【摘要】：外伤后细菌性致死性肉芽肿(Fatal bacteria granuloma after truma,FBGT)是一种病程短、致死率高的新疾病，21世纪前还未被皮肤病学界所认识，直至1996年才由西京医院皮肤科发现并命名。多个病人的皮损行透射电镜检查，发现炎细胞内外存在类似短杆菌，将患者皮损组织行多次严格的细菌培养，发现致病菌为一种革兰阳性厌氧短杆菌，细菌生化鉴定支持本致病菌为痤疮丙酸杆菌(propionibacteria aches, P.acnes)或放线菌，而API系统鉴定为P.acnes，并且根据该致病菌药敏试验结果挽救了一例患者。 1．外伤后细菌性致死性肉芽肿致病菌分子生物学鉴定通常认为P.aches是一种皮肤的常驻菌群，其致病力很低，但在FBGT中可以引起患者死亡，这一点和已知P.acnes特性不符合，随之出现一个问题，从FBGT皮损中分离出来的致病菌是否确实是P.acnes?虽然API系统鉴定为P.acnes，但该致病菌生化鉴定难以确定其种属，有必要进行深入研究，明确其分类。现代微生物学提出的多相分类(polyphasic taxonomy)，第四军医大学硕士学位论文包含表型、基因、系统发育等信息，是研究细菌分类的最有效手段，其中，165 rRNA序列测定可以判定系统发育信息，适用于细菌的各级分类[5]，而DNA一DNA杂交可以确定DNA同源性，是确定正确分类地位的重要方法〔6]。同样，这些方法也可以用来对未知细菌进行鉴定，确定其种属。我们对于FBGT皮损中分离出的致病菌进行165 rRNA序列测定，并将测序结果在Genebank中进行 Blast分析，与国外报道的P. aeneS16S rRNA序列同源性达到99.9%，确认其为P.acnes。为了保证结果准确无误，我们又进一步委托中国科学院微生物所将该致病菌和P.acnes标准株进行DNA一DNA杂交，结果显示两者DNA同源性)70%，可以确定两者为同一种细菌。上述实验证实FBGT患者皮损中分离出的致病菌为P.acnes。 2.外伤后细菌性致死性肉芽肿动物模型初步构建 FBGT作为一种感染性疾病，深入研究其发病机理，探索其治疗措施离不开动物模型的支持，因此构建本病动物模型成为深入研究本病的关键。构建细菌感染动物模型的成功标准，国际上公认的是郭霍定律Iv] (K0ch’ 5 Postulates)，其基本内容是:1.微生物只存在于患病的动物体内，在健康动物体内不存在;2.微生物必须从动物体内分离培养出来;3.接种纯培养微生物到健康动物体内可以致病;4.注射微生物后动物出现病变，再一次分离培养出原来致病菌。根据预实验结果，我们选择家兔进行研究。采取的实验方法主要是:首先利用皮质激素制造家兔的免疫抑制状态，然后将纯培养的对数生长期致病菌及P.acnes标准株配制成细菌悬液，注射入家兔皮内，观察注射部位的反应及实验动物的全身情况。将注射部位出现的皮损分别行组织病理、电第四军医大学硕士学位论文镜检查及细菌培养:并对培养出的细菌行API鉴定及165 rRNA 序列分析，并根据临床资料选择不同类药物进行药敏试验;部分出现神经系统症状的动物及时行MRI检查，并取其脑组织进行组织病理、电镜检查及细菌培养。实验结果显示，所有家兔注射部位出现红斑，注射低浓度(1 x106/mL)细菌的红斑数日内消失，而注射高浓度(9 xlo勺mL) 细菌导致的红斑则持续时间较长，部分发展为脓肿，可以从皮内脓肿中再一次分离培养出革兰阳性短杆菌;两组共5只家兔出现神经系统症状(单侧眼球突出或下肢瘫痪等)，其中注射高浓度标准株的有2只，而注射高浓度P.acnes临床株的有3只，说明P.acnes标准株和临床株均可在家兔身上致病。注射P.acnes临床株的家兔有l只在初次注射两周后死亡，未查明其死亡原因;其余4只出现神经系统症状的家兔的背部注射部位也同样出现红斑脓肿，但其头皮注射部位的红斑在第一次注射4周左右逐渐消退，变为质地较硬的结节，组织病理发现多核巨细胞聚集，在一定程度上类似FBGT患者的组织病理结果; 出现神经系统症状的家兔脑组织病理结果为脑水肿明显，有较多淋巴细胞浸润，但未见多核巨细胞，脑组织未培养出所注射细菌。从家兔皮损中分离出的细菌传代分离纯菌，行API鉴定及165 rRNA序列测定均符合P.acnes。实验结果符合郭霍定律，构建成功FBGT动物模型。本实验结果确认FBGT的致病菌是P.acnes，加深了对FBGT 的认识;并利用家兔构建成功FBGT的动物模型，为进一步深入研究本病的发病机理打下了一定的实验动物学基础，对构建更加完备的动物模型有一定启示。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R378
【图文】：

电泳图,电泳,细菌DNA,PCR扩增

1.3.1.1165rRNA基因PCR产物提取细菌DNA后，利用所设计165rRNA引物行PCR扩增，扩增产物行电泳发现在约1500bp左右出现明显条带(图1一A)，证实提取成功。

红斑,细菌悬液,流脓,浸润性

一A:注射后1日出现红斑;

红斑,浸润性,细菌悬液,流脓

并且注射9x105/mL细菌悬液组部分皮损出现破溃、流脓，但注射lx106/mL细菌悬液组内各家兔均未出现破溃流脓。图2一A:注射后1日出现红斑;图2一B:注射后3日，红斑达到最大，周围呈浸润性;

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