人抗体Fab段天然抗体库的建立

发布时间：2020-07-14 04:37

【摘要】：目的:提取健康人外周血淋巴细胞的mRNA,利用反转录PCR方法,建立一个大容量的人抗体Fab段的天然抗体库。方法:收集健康者外周血,提取淋巴细胞,以淋巴细胞mRNA为模板,扩增人抗体Fab段,连入载体pComb3内,利用电转化的方法,构建噬菌体抗体库。结果:最终建立了重链库为1.73×107,轻链库为8.52×104的天然抗体库,并利用酶切鉴定计算出实际库容为重链库1.21×107,轻链库4.26×104,所以理论上所建天然噬菌体抗体库总的库容量可以达到5.15×1011。结论:成功构建了一个大容量的完全人源化的天然抗体库。
【图文】：

2　结果2. 1　Fd段、κ链、λ链PCR扩增结果　将获得mRNA全部反转录,所得cDNA为模板进行PCR,结果如图1所示。图1　Fd段、κ链、λ链PCR扩增结果1: Fd段PCR产物; 2:κ链PCR产物; 3:λ链PCR产物; M: DNAmarkers.2.2　抗体库的建立　将连接产物进行电转化,将转化后菌液涂布氨苄青霉素平板, Fd库以1/1 0000的比例涂板,轻链库以1/100的比例涂板,计数平板上的菌落,假设一个菌落为一种抗体,计算转化率。最终建立重链库1. 73×107,轻链库8. 52×104。这样

抗体库进行了鉴定。将抗体库取10μL, 100倍稀释,涂布平板,挑取单个克隆,摇菌过夜,提取质粒,做酶切鉴定。每个库随机挑取10个单克隆(图2)。从图2可以看出,重链库中有70%正确克隆,所以实际的库容量为1. 21×107。轻链库中有50%正确克隆,所以实际库容量为4. 26×104。实际的总库容量为5. 15×1011。图2　Fd段库、轻链库酶切鉴定1-10: Fd段库酶切鉴定; 11-20:轻链库酶切鉴定; M: DNAmarkers.3　讨论要构建大库容量的抗体库,淋巴细胞的量至少要达到107以上,因为人类天然抗体库的重链即有107的多样性。只有淋巴细胞的量达到这个数量级,才有可能将每一种抗体基因都扩增出来。本研究从1 150mL的外周血分离的淋巴细胞共计约2. 3×109,这为成功地构建大库容量的抗体库提供了基本的保证。为了尽可能全面的扩增出抗体家族的各成员的抗体片段

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本文编号：2754497