人CD81基因克隆与真核表达载体的构建及其在细胞内的表达

发布时间：2020-07-19 17:16

【摘要】： 丙型肝炎病毒(HCV)感染呈全球性分布，目前全球感染率约3％，该病原常可引起持续感染，并且与肝硬化和肝细胞肝癌的发生密切相关，是当前严重危害人类健康的重要传染病。由于HCV体外培养尚未成功，至今仍无满意的细胞和动物感染模型，极大地限制了HCV的研究及丙型肝炎的防治工作。 HCV感染致病机制尚未完全阐明。HCV为一单股正链RNA病毒，属于黄病毒属嗜肝病毒科，其基因组编码的糖蛋白E1、E2构成了其高度有序的表面结构，其上可能存在与宿主细胞受体结合的配体表位。业已证明，病毒与细胞表面相应受体的结合是病毒感染复制过程中的始动环节，是决定病毒的宿主特异性、组织嗜性及致病性的主要因素之一。 Pileri等报道他们找到同E2结合的细胞表面分子，并经测序证明为CD81，推测CD81是HCV的受体。因此，设想利用HCV受体或受体配体的模拟分子阻断HCV入胞，可望为抗病毒治疗提供新策略，并且可依据这种相互作用设计疫苗。 然而，目前国内尚无较为完整的人CD81基因克隆及其与作为HCV受体的研究资料。为了进一步了解CD81在HCV感染中的作用，了解人CD81基因在不同种属细胞株中表达状况，探讨建立受体介 第四军医大学硕士学位论文 导的细胞感染模的方法，本研究应用分子生物学方法完成了以下 三方面的工作: 1.人CD81基因编码区的克隆 根据已公布的人CDS IcDNA序列(核酸库中的编号:NM- 004356)，设计一对引物，然后取传代后的人Molt一4细胞，按照 产品操作说明书从人Molt一4细胞提取总RNA，运用RT一PcR及PcR 方法扩增出人CD81基因，PCR产物经l%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小 正确。 2.人CD81真核表达载体的构建 应用TA克隆方法将扩增出的基因片段插入pMD一18T载体， 进行基因序列测定;选取正确的人CD81基因分别定向克隆入真核 表达载体pVAXI及pcDNA3.1(+)，构建两种相应的重组质粒 pvAXI一CD81与pcDNA3.1一CD81，然后分别采用酶切及PcR方法进 行鉴定，确定其插入大小及方向。 3.人CD81分子在不同来源细胞中的表达 通过脂质体介导，将pVAXI一cD81转染至非洲绿猴肾细胞系 COS一7细胞，pcDNA3.1一CD81转染至人肝癌细胞系H即仇细胞，采 用间接免疫荧光法(IFA)检测CD81基因在COS一7细胞中的表达， 采用免疫组织化学方法(胡C法)及流式细胞技术(FACS)定性及 定量的检测CD81基因在HepGZ细胞表达状况。 结果: 1.成功地从人Molt一4细胞克隆了人CD81基因。 2.插入pMD一18T载体的CD81基因序列分析与与Genebank公布的 序列完全一致;成功构建人cD81真核表达载体pvAxl一cD81与 pcDNA3.1一CD81，分别采用酶切及PCR鉴定，电泳可得到大小约 729bp的片断。 3.重组质粒pVAXI一CD81转染COS一7细胞，IFA检测发现COS一7 细胞表面能有效表达CD81分子。 第四军医大学硕士学位论文 4.重组质粒pcDNA3.l一CD81转染至HepGZ细胞，结果表明人cD81 分子可在H即GZ细胞中有效表达，应用流式细胞技术(FACS)检测 到荧光强度为38.8%，明显高于对照组。 结论: 1.本研究结果说明，应用RT一CR方法可以从Molt一4细胞成功地 克隆人CD81基因，并用于受体重建的研究。 2.异种COS一7细胞和人H即G:细胞不表达人CD81分子，抗人CD81 单抗与猴CD81无交叉反应，可作为HcV体外感染细胞模型的候选 细胞。可为证实CD81在HCV感染中的受体地位，进一步阐明HCV 感染细胞的机制提供依据。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

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本文编号：2762715