肺表面活性物质相关蛋白A1在大肠杆菌及酵母中的表达与纯化

发布时间：2020-07-31 19:30

【摘要】： 呼吸窘迫综合征是一种严重危害人类健康的原发性或继发性疾病，主要病因是肺表面活性物质（PS）的缺乏或者功能不足。PS替代治疗是唯一有效的治疗手段，目前临床所使用的PS主要为动物肺组织和人羊水提取物，但是制备比较困难，产品价格昂贵，不能满足临床的迫切需要，因此人工合成磷脂和肺表面活性相关蛋白质基因工程产物生产PS将是获得大量PS的理想途径。肺表面活性物质相关蛋白A（SP-A）在调节磷脂代谢、调控其它相关蛋白质基因表达、发挥内在免疫方面具有极其重要的功能。人SP-A基因定位于染色体10q21-24，由两个功能基因SP-A1、 SP-A2和一个假基因组成，两种基因产物有97％的同源性。人SP- A（hSP-A）属糖结合蛋白家族，主要由Ⅱ型上皮细胞合成。SP-A单体由248 氨基酸组成，相对分子质量约26～38kDa。本研究将正常中国人SP-A1 基因克隆至多种表达系统并获得高效表达。将hSP-A1基因克隆到原核表达载体pGEX-2T，转化至E.coli JM101、JM105、JM109、XL1-blue和BL21（DE3）等不同宿主中表达，经 IPTG诱导后目的蛋白质GST/SP-A1的表达量为6-15％，于28℃时，该基因在BL21（DE3）宿主中表达产物均为完整蛋白质（52kDa），表达产物占总蛋白质10％，而其它宿主中均有不完全蛋白质（41kDa）表达。经包涵体纯化和GST-Purification Kit纯化得到52kDa的融合蛋白质，纯度为 95％，Thrombin酶切后可得到26kDa的SP-A1，两者均能被抗-SP-A 的多克隆抗体识别，具有较好的免疫反应性。GST/SP-A1免疫兔和小鼠获得的多克隆抗体能识别天然的SP-A。重组pVT105U/α-SP-A1转化Saccharomyces cerevisiae S-78，在酵母普通培养基及营养丰富培养基中表达出相对分子质量分别为62kDa和32kDa的蛋白质，表达量约200mg/L，经Sephadex G-25 层析柱分批脱盐和 Sepharose 4B层析，纯度达到 95％，目的蛋白质可被兔抗人－SP－A多克隆抗体和鼠抗人－SP－A单克隆抗体特异性识别，体外杀伤实验表明SP－AI 能增加肺巨噬细胞对E．COIi 的吞噬和清除功能。将人SP－AI基因克隆至酵母分泌表达载体PPICg，转化至甲醇营养酵母 Pichia pastoris，得到大量表型是His”Mut“（A0xl＋A0xZ“）的重组菌株和少量表型为 HIS”MSt’M－AOXZO的重组体，以甲醇诱导AOXI 启动子高效表达的SP－AI，表达量约为400mg／L，用Sephadex G－25层析脱盐和Sepharose 4B层析得到相对分子质量约32kDa的目的蛋白质，具有调理肺巨噬细胞对病原体的吞噬作用。综上所述，SP－AI在大肠杆菌、S。CChs。OWC。S C。”””‘S“” S－78、Pichia P。storis中获得表达，酵母表达产物具有调理肺巨噬细胞吞噬病原体的活性，后者的表达产物活性更高，且可高密度发酵诱导表达。
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2000
【分类号】：R341

【参考文献】