CTB基因和CTB-ureB融合基因水稻表达载体的构建及其转化

发布时间：2020-08-03 06:52

【摘要】： 自从1983年第一个转基因植物问世以来，植物基因工程的发展日新月异，在植物抗病毒、抗虫、抗除草剂、抗逆性品种改良和外源基因表达等方面取得了举世瞩目的成就，转基因植物作为廉价的生物反应器生产人类所需要的各种药物原料展示了诱人的前景。水稻是世界上最重要、种植范围最广的粮食作物。当今，以水稻为代表的禾本科植物的转基因技术取得了重大突破，水稻表达异种蛋白成为可能。通过转基因技术，以水稻为表达系统生产安全和廉价转基因疫苗、抗体、乃至细胞因子，不仅是医药基因工程研究的进步，也是使水稻从简单的粮食作物转变为具有高附加值的功能性食品的重要途径。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因子，并被WHO列为与胃癌发生密切相关的病原菌，认为是人类第Ⅰ类致癌原(Group Ⅰ carcinogen)。疫苗的使用将是预防Hp感染的最有效方法。本研究拟通过植物转基因技术，将Hp ureB基因和佐剂CTB基因转入水稻染色体DNA，并获得稳定遗传的再生植株，为建立以水稻为生物反应器表达微生物抗原及其Hp转基因植物疫苗的研究奠定基础。方法 1．构建CTB基因的水稻表达载体p13W4-CTB：以pGEM-CTB为模板，PCR扩增CTB基因，BamHI酶切载体p13W4并去磷酸化，然后与同样酶切的CTB PCR产物连接，PCR筛选、酶切鉴定阳性克隆，进行DNA序列分析验证。 2．构建CTB-ureB融合基因的水稻表达载体pCWUN： (1)CTB、ureB基因的融合及克隆：采用高保真PCR技术，分别从质粒pGEM-CTB和幽门螺杆菌基因组DNA中扩增出CTB和cagA基因，然后通过PCR法融合两个基因，最后将CTB-ureB融合基因插入载体pUC19，PCR筛选、酶切鉴定阳性克隆，进行DNA序列分析验证。 (2)水稻Wx启动子的改造：采用高保真PCR技术，从质粒p13W4中扩增出Wx启动子，ΩK5′ 和3’引物72℃退火延伸获得产物OK片段，然后通过PCR法融合两个片段，获得Wx一QK融合片段。 (3) CTB一ureB融合基因的水稻表达载体pCWUN:PCR合成NoS终止子，从质粒PUCU上切下 CTB一ureB融合基因，然后依次将NOS终止子、CTB一ureB融合基因和Wx一OK融合片段插入质粒 PCAMB认1300，筛选、鉴定重组质粒PC认几刀叮。 3.水稻表达载体P13w4一cTB和pcWIJN分别转化感受态根瘤土壤杆菌，经过PcR筛选和酶切鉴定，获得根瘤土壤杆菌转化子。 4.水稻幼胚诱导胚性愈伤组织，然后根瘤土壤杆菌介导表达载体P13W4一C，转化水稻胚性愈伤组织，经过抗性筛选、分化和生根培养获得转基因植株，PCR鉴定转基因植株。结果 1 .PCR分析、酶切鉴定及其DNA序列分析证实CTB基因已经以正确方向插入到载体P13W4中，而且所克隆的基因与报道的相应核昔酸序列同源性为100%;NOS终止子、CTB~ureB融合基因和W卜。K融合片段也以正确方向、相应的次序插入到载体pCAMBIA1300中，CTB一ureB融合基因读码框正确，将其与GenBank中公布的相应基因序列比较，CTB基因序列的同源性为100%，推定氨基酸序列同源性也为100%。讲eB基因序列同源性为%.0%一97.7%，氨基酸的同源性为98.8%一99.5%。 2.PcR分析、酶切鉴定证实水稻表达载体P13W4一cTB和pCWUN分别成功转化感受态根瘤土壤杆菌。 3.PCR分析证实水稻幼苗的染色体DNA中已经整合了CTB基因。结论 1.成功构建了水稻表达载体pl3W4一CTB和pWCUN，并经序列分析证实序列无误。 2.水稻表达载体p13w4一CTB和pwcUN成功转化根瘤土壤杆菌。 3.根瘤土壤杆菌成功介导p13W4一CTB转化水稻，获得转基因植株。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R346

【参考文献】