扫描探针显微术用于人外周血淋巴细胞及淋巴细胞表面分子的数量化与可视化研究初探

发布时间：2020-08-06 15:33

【摘要】： 本文主要采用原子力显微术(AFM)和近场光学显微术(NSOM)对人外周血淋巴细胞的表面形态和超微结构进行了纳米级高分辨的成像研究，并结合量子点探针标记技术和NSOM成像技术，对人外周血T淋巴细胞表面的一些膜蛋白分子进行高分辨的荧光成像，突破了传统光学显微技术由于衍射极限造成的分辨率限制，实现了直接使用光学方法对细胞膜表面分子进行原位的分子级的高分辨观测，对膜表面分子的数量和定位进行了研究。在此基础上，对不同生理状态下淋巴细胞的形态和其表面分子的变化进行了观测。对扫描探针显微术在细胞生物学领域的应用进行了一些初步的探讨。 主要工作包括应用AFM和NSOM，对处于静息期的单个人外周血淋巴细胞的表面形态及光学性质进行了观测，AFM观测结果显示静息期的单个淋巴细胞基本都呈规则的球形，表面较为平整，但也存在一些细微突起的结构。NSOM的结果则显示了未经染色处理的淋巴细胞内部丰富的光学信息，可见到细胞内部明确的区域划分，以及一些呈现独特光学性质的区域，并对不同类型的NSOM成像结果进行了探讨。 在此基础上，使用AFM和NSOM进一步对活化的淋巴细胞的形态和荧光性质进行了观测，发现随着活化时间的增加，淋巴细胞的形态发生明显的改变，体积明显变大，细胞表面粗糙度明显增加，表面微观结构明显趋向更为复杂，并出现一些新的构造。NSOM成像的结果则首次清晰显示了淋巴细胞活化过程中其自发荧光的变化，荧光强度呈现逐步加强。荧光的分布则呈现在某些区域发生聚集的现象，并且其分布存在一定的规律。这些变化显示淋巴细胞激活后细胞表面积明显增加，结构和功能复杂化，显然是与淋巴细胞的蛋白分子相继大量表达和与外界信息交流增加等免疫生理功能密切相关的。 在对淋巴细胞活化的形态观测的基础上，使用NSOM，并结合量子点荧光探针，对静息T淋巴细胞和不同活化时段的T细胞的膜蛋白分子CD2、CD3、CD25、CD69进行了量子点荧光标记和高分辨成像，所得结果清晰的显示了这些分子在细胞表面的分布，以及在不同生理阶段的空间和数量表现，实现了在分子水平上对细胞膜表面分子的数量化和可视化研究，并对这些分子之间的空间关系和时间关系进行了探测和初步的探讨，发现随着活化程度的加深，CD2、CD3等分子出现聚集的现象，这很有可能显示了淋巴细胞表面“脂筏”在活化过程中的分子募集现象。并首次发现CD3和CD69在细胞表面的定位分布上存在十分紧密的关系，但其相对空间位置在不同的活化途径下有不同的表现，在ConA刺激下CD3和CD69有相同的分布位点，而与CD2，CD25之间在位置分布上则基本没有规律可循。 进一步结合偏振荧光成像技术，对淋巴细胞表面的CD3分子的量子点荧光标记的空间取向进行了研究，试验结果显示，在不同偏振条件下，细胞表面荧光分子NSOM图像完全不同，不同取向的荧光位点分布是各不相同的。结果对研究这些分子在淋巴细胞活化和生理功能中的作用等方面提供了一些很有价值的材料。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392
【图文】：

1.2.23淋巴细胞表面局部的高分辨观察应用AFM对单个静息淋巴和活化后的淋巴细胞表面的局部和边缘的超微结构进行了分析，从图6中我们可以看到，A为未经刺激活化的淋巴细胞表面的形态，可见其表面较为均匀，但并非平整光滑，存在一些微小凸起。图6B、C、D为活化后的淋巴细胞表面的一些超微结构，从B中可以看到，淋巴细胞表面出现的凹陷和孔洞，而在图6C中，可以看到细胞表面的微小颗粒明显较未活化前增加，细胞表面的形态明显变得更为复杂多样了，而图6D显示的则是淋巴细胞活

图7A和B分别是2个经过流式细胞仪筛选出来的未经活化处理的T淋巴细胞，4个小图分别为该细胞的AFM整体形貌图，截面高度曲线图，3D模型图和表面局部超微结构1.2.2.5淋巴细胞膜骨架的AFM研究初探有别于其他的显微技术，AFM是一种以力探测为原理的仪器，这使它可以作一些不一样的事情，目前已有许多以荧光标记技术来对细胞骨架进行研究的报道，在这里我们尝试不经过标记，用AFM直接对淋巴细胞的骨架进行观察。去垢剂为双极性分子，可在水中溶解。除胆酸盐外，去垢剂分子通常是由线性或带有分枝的碳氢化合物尾部和结构各不相同的亲水性头部组成。去垢剂的一个重要特性就是可以形成分子团结构。当膜蛋白与去垢剂分子接触时，膜蛋白的疏

娉嚅⒔峁菇鈉辛松缢?上文中的AFM图像均为敲击模式下获得)，在这种扫描模式下，AFM探针始终“压”在样品表面。通过接触模式扫描，获得了淋巴细胞表面的超微结构，结果如图8所示，从图中可见，细胞表面凸现出了一些规则的网格状结构，这与未处理前的淋巴细胞表面是明显不一样的，网格的间距为100nm左右。在经过非离子去垢剂处理后，细胞膜已经变得脆弱疏松，在AFM探针的压迫下，凸现出来的很有可能是对细胞膜下的支撑结构，也就是细胞膜骨架结构。0一田1.的图8经过 Triton一X100处理的淋巴细胞表面的超微结构，膜表面凸现出规则的网格状构造。扫描范围ZxZpm

【参考文献】

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本文编号：2782609