痢疾杆菌免疫及温度比较蛋白质组学研究

发布时间：2020-08-07 22:22

【摘要】：痢疾杆菌是一类通过侵袭入肠道上皮细胞并进行复制从而导致人类出现腹泻的革兰氏阴性细菌。主要传播途径为粪口途径,由于感染剂量极低(10-100个菌),所以最长见的扩散形式是人与人之间的传播。据保守估计,全世界每年的感染人数约1.647亿,发展中国家有约1.632亿人次。每年死亡人数有110万。在发展中国家中福氏痢疾2a血清型占大多数。由于人们对痢疾杆菌的致病机理和宿主的免疫保护机制还不十分清楚,所以迄今为止仍未研究出能有效控制痢疾较为理想的疫苗。本文首先使用免疫蛋白质组学手段对痢疾杆菌福氏2a 2457T株可能存在的抗原进行筛选和鉴定。分别提取了全菌体蛋白、膜蛋白、外膜蛋白以及胞外分泌蛋白,进行了不同pH梯度的双向电泳。对于痢疾杆菌的外膜蛋白建立了双向电泳参考图谱,通过软件分析在pH4-7 18厘米胶上计算出共126个点,其中109个进行胶内酶切并MALDI-TOF鉴定出87个,代表55种蛋白。结合根据基因组预测的外膜蛋白对鉴定的所有蛋白质点的等电点/分子量吻合程度、分布以及功能分类等进行了初步的分析。使用免疫家兔的血清,对不同组分的蛋白样品进行免疫印迹的研究,共找到23种蛋白质抗原,其中8种是已知抗原,15种为新抗原。有一个假想蛋白YaeT,功能未知,序列与Haemophilus influenzae的表面抗原D15以及Pasteurella multocida的oma87基因同源,免疫反应很强。有报道该基因在模拟的体内环境中转录水平提高,推测可能与痢疾杆菌的侵袭能力有关,值得进一步深入研究。痢疾杆菌毒力的表达是温度相关的。当在37℃培养时痢疾杆菌表现出完整的毒性以及对Henle细胞的侵袭力,但是在30℃培养时则明显减毒及丧失侵袭力。本实验在以前工作的基础上改进方法,对30℃及37℃培养时菌体蛋白进行了双向电泳的比较,找到59个差异蛋白点,对应于53种蛋白质。结果显示,在30℃培养时检测到42种蛋白上调,12种蛋白下调(TufB既上调又下调)。通过对结果的分析,推测庄30℃培养时细菌的乙醛酸循环增强,蛋白质合成加强以及嘌呤合成的增加。其中庄免疫蛋白质组学工作中检测到的假想蛋白YaeT表达量也出现增加。由于在电泳图谱上ArgT的变化十分显著,而在大肠杆菌中人工强制表达时不论在30℃还是37℃培养时均可以获得高表达,但是在痢疾杆菌中表达时则只有在30℃时可获得高表达。因此我们使用Red重组系统构建了argT失活的突变体,在30℃和37℃培养条件下分别与原始的2457T株进行双向电泳图谱的比较并得到了一些差异
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R392
【图文】：

电泳图,胶条,电泳,蛋白

AU图2:24s7T全菌体蛋白使用pH4.s一pHs.s胶条电泳及WesternBlotting结果。ApH4.5一pHS.5双向电泳银染色图，100陀上样量;BpH4.5一pHS.5双向电泳，WeB10tting，lmg上样量。其它实验条件参见图1。表1全菌蛋白中鉴定出的有免疫反应的蛋白质SPotIDProteinCommonNameGeneSymbolNCBIGlldentlfiC「FUnCt一onMa一nro!eoctlAPatgvaloafR的IR085R(洲)2R003R004R〕)8ROI4Rol6R037R《洲)5R】71ehapeorneHsP70:autoerguladetheatshockPoretindnaK91}30061584Proet一nt’ateGroEL，ehapeorneHs两0，pePtide一ependent肖】、Pase，heatshockPorteinmoPA91130065518PortelnafteOuetrmembranechannell’oICeellularPorcesses91130仅抖385

双向电泳,亮蓝,膜蛋白,小时数

军事医学科学院博丝鱼丝第一部分245T7的丝夔迥竺图3:2457T斯亮蓝染色，膜蛋白双向电泳以及westernBloftnig结果·ApH4一7双向电泳，lmg上样量;BpH4一7双向电泳，wcsternBlotting，1mg上样量。考马水化12小时，500VI小时，1000VI小时，8000V至总伏小时数为50000Vhs。水化液与裂解液均为7MUera/ZMThiourea/4%CHAPS/60mMDTT/0.5%IPGBueffr。bl一6703520032551‘a—只100飞M曰Elt319[已内9964了

外膜蛋白,双向电泳,图谱,小时数

AB图5:2457T外膜蛋白不同pH梯度双向电泳图谱。ApH3一10;BpH4一7。裂解液与水化液均为SMUrea/ZMThiourea/2%CHAPS/2%SB3一10/50mMDTT/.05%PIGBueffr。电泳条件:1scm胶条，.0smg上样量，静置水化6小时，30V6小时，500VI小时，1000VI小时，8000V至总伏小时数为50000VhS。

【引证文献】