志贺氏菌福氏2a侵袭质粒抗原IpaC作用蛋白的研究

发布时间：2020-08-09 01:00

【摘要】：细菌性痢疾是一种全球性肠道的传染病，至今仍威胁着人类健康和生命，引起该病的病原体为属于革兰氏阴性的志贺氏菌。我们国家所流行的细菌性痢疾主要是由志贺氏菌福氏2a引起的。志贺氏福氏菌是一种兼性胞内细菌病原体，通过一种称为病原体诱导的胞饮过程侵袭人结肠上皮细胞。位于志贺氏毒性大质粒上的ipa(invasion plasmid antigen)操纵子对于编码和分泌侵袭质粒抗原蛋白是必需的，其编码四种分泌蛋白IpaB，IpaC，IpaD和IpaA。在细菌与上皮细胞接触时ida蛋白很快分泌出来，随后IpaB和IpaC形成复合体，而该复合体为病原体进入上皮细胞所绝对需要的。研究工作表明IpaC在痢疾的致病过程中起着非常重要的作用。为进一步了解IpaC在痢疾致病过程中的分子机理，从宿主细胞中寻找与IpaC相互作用的蛋白则不失为一可取的研究策略。酵母双杂交系统是一种在体内研究蛋白相互作用的有效方法。因此我们应用了酵母双杂交系统研究宿主细胞中与侵袭蛋白IpaC相互作用的蛋白分子。类似的工作国内外还未见报道。 本研究结合了分子生物学常规方法，酵母双杂交技术和生物信息学等手段对与侵袭蛋白IpaC相互作的蛋白进行了筛选和初步分析，有助与我们进一步了解痢疾杆菌在致病过程中的分子机制，还为侵袭蛋白IpaC及其相关的基础研究提供了新的思路，新方法。研究结果可概述为以下几个方面： 1．通过PCR方法从野生型志贺氏菌福氏2a(2457T株)中克隆了侵袭蛋白ipaC基因，测序结果表明与文献报导一致。 2．构建痢疾杆菌侵袭蛋白IpaC诱饵蛋白载体pGBKT7-ipaC并转化至酵母菌株AH109，Westem-blotting结果表明侵袭蛋白IpaC能在AH109中稳定表达。并对IpaC自身的转录激活活性进行了分析，结果表明IpaC自
【学位授予单位】：沈阳药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392
【图文】：

图1蛋白X与Y不相互作用则报告基因不表达如果这两个蛋白不相互作用，则带有转录激活结构域的GAL4AD一就无法停留在激活报告基因转录的启动子处，因此报告基因不表达，见图1。相反，如果这两个蛋白相互作用，则带有转录激活结构域的GAL4AD守就停留在激活报告基因转录的启动子处，同时使NRA聚合酶也靠近到启动子附近，从而激活报告基因的表达，见图2。Figure2AevtiationofthereP0rtergene1l

轮竞厥暇潿Pac基因的克隆及双杂交诱饵蛋白载体的构建对上述酶切鉴定正确的克隆进行基因序列测定，结果见图1一4。Figurel一SequeneeofPiaCgene图1礴PiaC基因序列测定图通过上下游测序和一个wal拓血g，经拼接我们得到了Piac基因的全长序列。将得到的序列和数据库进行同源性比较(结果未显示)，表明我们克隆的PiaC基因完全正确。

3、诱饵蛋白pGBKT7一Piac的构建及鉴定质粒pMDT.iPaC经Nc口I和asll双酶切，回收目的片段，与质粒pGBKT7经Nc口I和asll双酶切后，连接，转化大肠杆菌(见图1一5)。Fgiurel一5SehematierPeresentationofeonsrtuetionofercombniantPlas面dxePressnigPIaC图1一5诱饵蛋白质粒pGBKT7一ipac的构建过程目的基因片段与pGBKT7载体连接后，转化宿主菌DH5a。提取转化子质粒，Ncol和Sall双酶切鉴定，发现基因片段大小与预期结果一致，表明诱饵蛋白载体构建成功(见图1一6)，将该阳性重组子命名为pGBKT7一PiaC。测序结果表明PiaC基因与pGBKT7载体中GAL4的DNA

【共引文献】

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本文编号：2786354