大鼠肾缺血再灌注损伤模型肺内氧化应激状态及PrxⅥ的表达变化

发布时间：2020-08-11 19:45

【摘要】：肾脏不仅能排泄体内代谢废物,维持机体钠、钾、钙等电解质稳定及酸碱平衡,还具有内分泌功能。因此,肾脏对维持整个机体内环境的平衡至关重要。有研究表明:当肾脏功能受损时,其邻近和远端器官如心、肺、肝、肠和脑等的功能也会严重受损[1]。肾缺血再灌注损伤(Renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是急性肾动脉阻断或肾脏移植等临床治疗过程中常见的病理生理过程。它也是导致肾移植后功能恢复延迟或病人发生急性肾衰的重要因素。当肾脏发生缺血再灌注时会产生大量的活性氧族(reac-tive oxygen species,ROS),使肾脏处于高度氧化应激状态,这也是缺血再灌注损伤的重要机制之一。ROS包括超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH-)和过氧化氢(H2O2)等。ROS化学性质非常活泼,可以破坏细胞内的蛋白质、DNA和脂类等生物大分子,从而影响细胞功能,甚至引起细胞和组织死亡。Peroxiredoxin(Prx)是近几年发现的一类过氧化物酶系,Prx VI是其家族成员之一。Prx VI在哺乳动物肺部尤其是肺泡II型上皮细胞表达非常丰富。研究表明:Prx VI具有谷胱甘肽过氧化物酶的生物活性,其功能主要是负责还原H2O2和磷脂过氧化物等。用高浓度氧、百草枯、H2O2等物质处理大鼠肺上皮细胞引起氧化应激反应后,Prx VI的m RNA和蛋白水平会明显增强。当诱导Prx VI在肺上皮细胞系过表达时,能明显增强细胞分解H2O2的能力,抑制细胞过氧化反应的发生。Prx VI基因敲除小鼠肺组织内H2O2和MDA含量明显高于对照组。以上这些说明Prx VI在肺组织内具有较强的抗氧化应激功能,在清除ROS防止肺组织过氧化损伤中可能发挥重要作用。肺脏是机体内对氧含量非常敏感的脏器之一。当RIRI发生时,肺脏是否也会处于氧化应激状态,遭受过氧化损伤?Prx VI的表达水平如何改变?未见报道。本研究通过采用无损伤动脉夹钳夹肾动脉法建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型。24小时后观察肺组织内MDA含量、H2O2含量,以及Prx VI基因水平和蛋白水平的表达变化,探讨肾脏缺血再灌注损伤时肺组织的过氧化损伤程度,以及Prx VI在缺血再灌注损伤过程中的抗氧化作用,为防治RIRI引起的肺组织损伤提供一条新思路。目的:观察大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型肺内的氧化应激状态和抗氧化酶Prx VI基因和蛋白水平的表达变化,探讨Prx VI在RIRI诱发的肺组织过氧化损伤中的作用。方法:1肾脏缺血再灌注损伤模型的制备及取材雄性Wistar大鼠12只,体重200±10 g,购于河北医科大学实验动物中心,随机分为对照组(Control)和肾脏缺血再灌注损伤组(RIRI),每组各6只。用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5ml/kg),参照余晓东等人的方法制备肾脏缺血再灌注损伤模型。RIRI组大鼠开腹后暴露其双侧肾脏,先切除右肾,然后钝性分离左肾动脉,在靠近肾门处用无创动脉夹夹闭左肾动脉,观察肾脏由鲜红色逐渐变为暗红色。45 mins后松开动脉夹,恢复血液供应,肉眼可见肾动脉充盈,肾脏由暗红色迅速变为鲜红色,表明再灌注成功。对照组大鼠开腹后只切除右肾,分离左肾动脉,但不夹闭左肾动脉。24小时后收集血液,3000rpm离心10min,分离血清用于肌酐(Serum Creatinine,SCr)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)浓度测定;处死大鼠取肾脏和肺脏,将肾脏于4%多聚甲醛中固定进行HE染色,观察肾脏的形态学改变。将肺脏置于液氮中用于Prx VI m RNA和蛋白水平测定以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)和H2O2含量测定。2测定指标及方法2.1血清SCr和BUN水平测定血清SCr浓度采用苦味酸法测定;血清BUN浓度采用酶偶联速率法测定。2.2 HE染色观察大鼠肾脏的形态结构肾脏组织经常规脱水、透明,石蜡包埋后,切片厚约5μm,苏木精伊红染色,日本产Olympus光学显微镜下观察肾脏的形态变化并进行图象分析。2.3大鼠肺组织MDA含量测定将从-70℃冰箱中取出的肺组织按照10mg/100μl加入预冷的匀浆缓冲液(50mmol/L磷酸钾缓冲液,PH7.4,1mmol/L盐酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巯基乙醇),冰浴中匀浆,匀浆液4000rpm 4℃离心20min,取上清即制成10%肺组织匀浆,肺组织匀浆内MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)测定试剂盒测定。2.4大鼠肺组织H2O2含量测定将从-70℃冰箱中取出的肺组织按照10mg/100μl加入预冷的匀浆缓冲液(50mmol/L磷酸钾缓冲液,PH7.4,1mmol/L盐酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巯基乙醇),冰浴中匀浆,匀浆液4000rpm 4℃离心20min,取上清即制成10%肺组织匀浆。肺组织匀浆内H2O2含量采用钼酸比色法测定,以每克样本蛋白所含的过氧化氢的量(mmol/g pro)表示。2.5大鼠肺组织Prx VI m RNA水平测定用TRIzol法提取肺内总RNA。约3μg总RNA反转录成c DNA。以GAPDH为内对照,进行RT-PCR。分别以Prx VI的扩增产物与GAPDH灰度值之比表示目的基因的相对表达量2.6大鼠肺组织Prx VI蛋白水平测定采用Western blot法测定大鼠肺组织Prx VI蛋白水平。将大鼠肺组织制成匀浆,离心后取上清。用改良Lowry法进行蛋白总量测定.电泳的蛋白上样量为64 ug.经过转膜和封闭处理后,在PVDF膜上加入兔抗Prx VI抗体,室温静置过夜。再加入荧光标记的抗兔Ig G抗体.在双色红外线成像系统扫描照相并进行图像数值分析。结果:1大鼠肾组织的形态学改变光学显微镜下可见正常组大鼠肾血管球、肾小囊、近曲、远曲小管及集合管形态结构清晰规整。而RIRI组大鼠可见肾血管球萎缩,体积变小;肾小囊腔扩张;肾小管管腔明显扩张,个别近曲小管上皮细胞水肿,胞浆疏松化;肾间质水肿,肾小管间隙扩大;集合管出现管腔扩张、上皮水肿等改变。2血清SCr水平Con组大鼠血清中SCr的浓度为103.444±8.465μmol/L,而RIRI组血清SCr的浓度为131.153±17.814μmol/L。RIRI组大鼠血清SCr浓度明显高于Con组(P0.05)。3血清BUN水平Con组大鼠血清BUN的浓度为4.462±0.541 mmol/L,而RIRI组血清BUN的浓度为13.685±4.397 mmol/L。RIRI组大鼠血清BUN的浓度明显高于Con组(P0.05)。4肺匀浆内MDA的含量Con组大鼠肺匀浆内的MDA含量为7.63±1.68mmol/g,而RIRI组肺匀浆内的MDA含量为10.89±1.74 mmol/g。RIRI组大鼠肺匀浆内的MDA含量明显高于Con组(P0.01)。5肺匀浆内H2O2的含量Con组大鼠肺匀浆内的H2O2含量为16.51±2.39 mmol/g,而RIRI组肺匀浆内的H2O2含量为21.85±4.16 mmol/g。RIRI组大鼠肺匀浆内的H2O2含量明显高于Con组(P0.05)。6肺组织Prx VI m RNA的相对表达量采用RT-PCR的方法测定大鼠肺组织内Prx VI m RNA的相对表达量。Con组肺组织内Prx VI m RNA的相对表达量为0.72±0.17,RIRI肺组织内Prx VI m RNA的相对表达量为1.09±0.23,RIRI组大鼠肺组织内Prx VI m RNA水平明显高于Con组(P0.01)。说明RIRI组大鼠肺组织内Prx VI的基因表达水平升高。7大鼠肺组织Prx VI蛋白水平Con组大鼠肺组织内Prx VI的蛋白表达水平为0.62±0.13,RIRI组大鼠肺组织内Prx VI的蛋白表达水平为0.88±0.16。RIRI组Prx VI蛋白水平明显高于对照组(P0.01)。说明RIRI组大鼠肺组织内Prx VI的蛋白表达水平升高。结论:1切除右肾后在靠近肾门处用无创动脉夹夹闭左肾动脉可成功建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型。2肾脏缺血再灌注损伤可使肺组织处于高度氧化应激状态,引起肺组织的过氧化损伤。3 Prx VI的基因和蛋白表达水平在RIRI模型肺组织中明显增强。提示Prx VI可能参与了缺血再灌注所诱发的氧化应激反应,对肺组织具有保护功能。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692;R-332

【参考文献】