重组谷氨酸脱羧酶（GAD）在BL-21细胞中的表达及条件优化

发布时间：2020-08-11 20:25

【摘要】： 谷氨酸脱羧酶(GAD)是胰岛B细胞的一种主要自身抗原，与1型糖尿病细胞免疫和体液免疫有密切关系，已广泛应用于临床，作为糖尿病预测、诊断、分型、疗效监测的重要依据。 本研究首先用PCR方法，以pUC18/GAD_(65)为模板，扩增目的基因，克隆到pGEM-T载体中，构建pGEM-T/GAD_(65)重组质粒，然后用EcoRI酶切，切下的目的基因片段插入pET42a融合型表达载体中，经酶切鉴定和测序，证实插入方向、读码框架正确；重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE_3)中诱导表达，表达产物经亲和层析纯化后获得了融合蛋白GST-GAD_(65)。SDS-PAGE电泳和Western Blot分别鉴定融合蛋白大小和免疫活性后，对表达条件进行优化，对包涵体进行分离、溶解和复性处理，以提高可溶性融合蛋白的产量，使融合蛋白达总蛋白的50％，相当于1.495g/每升培养物。 我们利用原核表达系统成功克隆并表达了具有免疫活性的大鼠脑GAD_(65)基因，并对表达条件进行优化，为今后基因工程大量生产应用于糖尿病临床检验和实验研究的GAD蛋白打下基础。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：Q55

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