人NMDA受体主亚基M3-M4环的原核表达、纯化与鉴定

发布时间：2020-08-12 01:55

【摘要】： N-甲基-D-门冬氨酸受体(NMDAR)是离子型兴奋性氨基酸受体的一种类型，该受体具有生理学和病理学双重作用，不仅与兴奋性突触传递、突触可塑性、学习和记忆等许多中枢活动密切相关，而且NMDAR过度激活所介导的神经兴奋毒性在急、慢性神经疾病、精神紊乱及神经病性疼痛综合征等病理状态下起重要作用。通过选择性干预NMDAR活动，可为相关致死、致残性疾患提供有效的防治手段。然而，尽管目前NMDAR拮抗剂或阻断剂多达数十种，但在临床前期实验中却因严重的毒副作用和有限的临床疗效尚未能普遍投入使用。因此，人们开始探讨新的抑制NMDAR功能的方法，兴奋毒性损害免疫防治方法在该领域是一种新的探索。本课题组通过生物信息学方法对人NMDAR主亚基(NR1)上受体激活相关多肽片段的理化特性、抗原性及自身免疫原性等进行分析之后，确定NR1膜蛋白胞外区M3-M4环靶片段更易成为NMDAR免疫干预的分子靶点。以此为靶点采用免疫干预的方法来调控NMDAR的激活状态，进而有望建立安全、可行的兴奋毒性脑损害免疫防治的方法。人NR1膜蛋白M3-M4环靶片段是由163个氨基酸组成的多肽，相对分子质量为18800，本研究采用基因工程方法获得该肽段，以用于进一步免疫原性及相关应用研究，为兴奋毒性脑损害免疫干预提供实验基础。一、脑胶质瘤组织总RNA的提取用Trizol试剂抽提新鲜脑胶质瘤组织总RNA，经紫外分光光度计测定RNA溶液260nm及280nm的读数，以进行RNA定量及纯度鉴定。二、RT-PCR方法扩增目的基因首先以总RNA的mRNA为模板，利用3′引物或其它下游引物进行逆转录反应；然后利用所合成的上、下游引物，采用PCR扩增出人NMDAR主亚基M3-M4 环的基因片段。三、PCR引物的优化改构为提高外源基因输水平，按照计哪辅助原核表达载体PBV220中外源基因高效表达的数学模型预测方法，优化改构洲PCR上游引物。其中 NA二级结构预测及局部密码子们性计算分别由RNAfold软件和Goldkey软件完成，并保证改构后引物与原始引物具有相同的醇切位点。四、原核表达台体pBVJqRIL3的构建用限制性内切N EcoR和 BalnH！分别消化目的基因和表达质粒 PBV220，通过T4DNA连接酶进行连接，构建表达质粒PBVJqRIL3。用表达质粒转化感受态大肠杆菌DH5a，通过酶切鉴定筛选阳性克隆，并以双脱氧末端终止法对提取的表达质粒进行基因测序。五、重组质粒pBV－N’RIL3在大肠杆菌中的诱导表达升高培养温度至 42℃诱导重组质粒 PBV－NRI L3在大肠杆茵中的表达，取诱导表达不同时刻菌体进行SDS－PAGE，以确定最佳诱导时间，并通过凝胶薄层扫描分析，确定目的蛋自占菌体蛋自的百分含量。同时取表达量最高时刻的首液离心收集茵体，冰浴超声破碎，通过SDS－PAGE，观察蛋自表达形式。六、表达产物的纯化在制验SDS－PAGE n上，电洗脱从胶片上切下的目的条带，使用透析法进行包涵体复性，通过冰干法，获得纯品粉末。七、表达产物的鉴定使用SDS－PAGE、Western印迹以及肽质话指纹分析等方法从相对分子质量、免疫反应性、蛋白质一级结构等方面进行分析鉴定，最终确定表达蛋自即为目的蛋白。综上所述，本研究以人脑胶质瘤组织总RNA为模板，采用RT－PCR方法扩增出人N’MDAR主亚基M3－M4环的基因片段，并成功构建了原核表达载体 pBV栅l L3。同时，按照计算机辅助原核表达载体 pBV220中外源基因高效表达的数学模型预测方法，将PCR引物进行优化改构，从而实现了目的基因的高效表达，并对越产物进行了纯化和鉴定。凝胶扫描分析表达量约占菌体总蛋白29％，蛋自纯度达95％以上。本研究解决了下一步研究所需的免疫原来源问题，为免疫干预NMD见治疗兴奋毒性脑损害打下重要基础。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R346

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